最大的不一樣是聚丙烯酰胺凝膠電泳原理（PAGE）用的蛋白質不做任何變性處置

SDS-PAGE中的SDS是十二烷基磺酸鈉，是蛋白質變性劑，SDS能離散蛋白質的折疊構造，然後沿擴展的多肽鏈的外表吸附。使肽鏈帶淨負電荷，蛋白質在電場中的泳動速度僅與蛋白質顆粒巨細有關。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理是由丙烯酰胺（簡稱Acr）單體和少數交聯劑甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）經過化學催化劑（過硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加快劑或光催化聚合效果構成的三維空間的高聚物。聚合後的聚丙烯酰胺凝膠構成網狀構造。具有濃縮效應、電荷效應、分子篩效應。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳通常可分紅12～25個組分。因而適用於不一樣相對分子質量物質的別離，且別離效果好。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理,效果：用於別離蛋白質和寡核苷酸。 聚丙烯酰胺凝膠電泳原理:聚丙烯酰胺凝膠為網狀構造，具有分子篩效應。它有兩種方式：非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的進程中，蛋白質能夠堅持完好狀況，並依據蛋白質的分子量巨細、蛋白質的形狀及其所順便的電荷量而逐步呈梯度分隔。

而SDS-PAGE僅依據蛋白質亞基分子量的不一樣就能夠分隔蛋白質。該技能開端由shapiro於1967年建立，他們發如今樣品介質和丙烯酰胺凝膠中參加離子去汙劑和強還原劑後，蛋白質亞基的電泳搬遷率首要取決於亞基分子量的巨細（能夠疏忽電荷要素）。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理簡稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis）  聚丙烯酰氨凝膠電泳，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支撐介質的一種常用電泳技能。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合進程由自由基催化完結。催化聚合的常用辦法有兩種：化學聚合法和光聚合法。化學聚合以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加快劑。在聚合進程中，TEMED催化過硫酸銨發生自由基，後者引發丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間發生甲叉鍵交聯，然後構成三維網狀構造。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理依據其有無濃縮效應，分為接連係統和不接連係統兩大類，接連係統電泳係統中緩衝液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場效果下，首要靠電荷和分子篩效應。不接連係統中因為緩衝液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不接連性，帶電顆粒在電場中泳動不隻有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其別離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不接連係統由電極緩衝液、濃縮膠及別離膠所構成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩衝液為pH6.7的Tris-HCl。別離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩衝液為pH8.9 Tris-HCl。電極緩衝液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩衝液。2種孔徑的凝膠、2種緩衝係統、3種pH值使不接連係統構成了凝膠孔徑、pH值、緩衝液離子成分的不接連性，這是樣品濃縮的首要要素。

SDS是陰離子去汙劑，作為變性劑和助溶試劑，它能開裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，損壞蛋白分子的二、三級構造。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵開裂。在樣品和凝膠中參加還原劑和SDS後，分子被解聚成多肽鏈，解聚後的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白- SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不一樣分子間的電荷區別和構造區別。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理通常選用的是不接連緩衝係統，與接連緩衝係統相比，能夠有較高的分辨率。

濃縮膠的效果是有堆積效果，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經過大孔徑凝膠的搬遷效果而被濃縮至一個狹隘的區帶。當樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩衝液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開端後，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少數的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷，因而一起向正極移動，其間氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開端時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因而在後麵構成低電導區，而電場強度與低電導區成反比，因而發生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子敏捷移動，構成以安穩的界麵，使蛋白集合在移動界麵附近，濃縮成一中間層。

此鑒定辦法中，蛋白質的搬遷率首要取決於它的相對分子質量，而與所帶電荷和分子形狀無關。

聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

一、意圖需求

（1）學習聚丙烯酰胺凝膠電泳原理原理和技能

（2）學習和把握SDS－聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳別離蛋白質技能

二、試驗原理

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理是由丙烯酰胺（簡稱Acr）單體和少數交聯劑甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）經過化學催化劑（過硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加快劑或光催化聚合效果構成的三維空間的高聚物。聚合後的聚丙烯酰胺凝膠構成網狀構造。具有濃縮效應、電荷效應、分子篩效應。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳通常可分紅12～25個組分。因而適用於不一樣相對分子質量物質的別離，且別離效果好。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理材料的特性

人工合成聚丙烯酰胺凝膠的化學係統的構成及功用：

Acr：丙烯酰胺

Bis：甲叉雙丙烯酰胺

AP：過硫酸銨——化學催化劑

TEMED：四甲基乙二胺——加快劑

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理是一種陰離子去垢劑，SO32-帶負電荷。在富含強還原劑的SDS溶液中可構成SDS-蛋白質複合物。因為結合很多帶負電荷的聚丙烯酰胺凝膠電泳原理，比如蛋白質穿上帶負電的“外衣”，蛋白質自身帶有的電荷則被掩蓋了。然後起到消除各蛋白質分子之間自身的電荷區別的效果。

三、試驗材料

（一）試劑

1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 為29:1） 稱取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去離子水溶解並稀釋至100ml，貯棕色瓶中於4℃保留，可用一個月。

2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl緩衝液  取1mol/L HCL溶液48ml、三羥甲基甲烷（Tris）36.6g，加雙蒸餾水至80ml使其溶解，調pH至8.8，然後用雙蒸餾水稀釋至100ml，置棕色瓶中，4℃儲存。

3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩衝液  取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加雙蒸餾水至80ml，調pH6.8，用雙蒸餾水稀釋至100ml，置棕色瓶中，4℃儲存。

4、Tris-甘氨酸電泳緩衝液   稱取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸餾水850ml，調pH至8.3，加蒸餾水到1000ml，4℃儲存。用時可做10倍稀釋。

5、10% 過硫酸銨（AP）（6）四甲基乙二胺（TEMED）或β-二甲基氨基丙腈（DMAPN）。

6、10%SDS（十二烷基磺酸鈉） 稱取SDS 10g，加蒸餾水100ml使其溶解。

7、四甲基乙二胺（TEMED）

8、上樣緩衝液  取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩衝液6.25ml，蔗糖10g，SDS 2.3g，1g/L溴酚藍10ml，加蒸餾水溶解，混合至100ml。

9、考馬斯亮藍染色試劑  考馬斯亮藍R250染色液：濃度為2.5g/L，用甲醇∶醋酸∶蒸餾水=5∶1∶5的溶液製造（V/V）。

10、脫色液：取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸餾水至100ml。

11、樣品：人血清。

12、蛋白質分子量象征物  市售中分子量蛋白質分子量象征物。也可選擇5種以上的已知分子量蛋白質自行製造，留意其分子量散布要能滿足需要，各種蛋白質的濃度根本持平。

（二）儀器  圓盤電泳槽（或垂直板電泳槽）、穩壓穩流電泳儀  、脫色搖床。

四、試驗辦法

（一）預備圓盤電泳槽、電泳儀。

（二）凝膠製備  按下表分別製造別離膠和濃縮膠（此量可供2人用）

別離膠(12%   5ml)        濃縮膠(5%   2ml)

ddH2O        1.6ml        1.4ml

30%混合液        2.0ml        0.33ml

1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl        1.3ml        —

1.0mol/L pH6.8 Tris-HCl        —        0.25ml

10%SDS        50µl        20µl

10%Ap        50µl        20µl

TEMED        4µl        4µl

留意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠後敏捷用滴管灌膠

（三）灌膠

1、先將膠管（5х90mm）封好底，將製造好的別離膠液灌寫入膠管內，約70mm高度（把握別離膠的高度），在凝膠外表悄悄加一層正丁醇液（約3～4mm）。用於隔絕空氣，使膠麵平坦。室溫下靜置約30～60min。調查膠和正丁醇之間的界麵，判別膠是不是凝結。要在承認別離膠完全凝結後才開端製造濃縮膠。

2、別離膠凝結好後，倒掉掩蓋在別離膠外表的正丁醇，並用去離子水衝刷一次，倒置吸淨殘留的水。將製造好的濃縮膠液灌寫入膠管內（約15mm），在凝膠外表悄悄加一層正丁醇液（約3～4mm），用於隔絕空氣，使膠麵平坦。室溫下靜置約30～60min。調查膠和正丁醇之間的界麵，判別膠是不是凝結。膠凝結好後，倒掉掩蓋在膠外表的正丁醇，並用去離子水衝刷一次，倒置吸淨殘留的水，預備加樣。

（四）樣品預處置和加樣

1、取血清0.1ml、上樣緩衝液0.9ml，混勻，在沸水中煮沸5min。

2、將膠管封底去掉，放入圓盤電泳槽中，套緊，不能有空的孔，將Tris-甘氨酸電泳緩衝液參加圓盤電泳上、下槽中，電泳緩衝液要蓋過膠管口，然後用微量加樣器（或注射器）將樣品10μl加到膠管膠麵內。

（五）電泳  上槽接負極，下槽接正極，先調電壓為120v/濃縮膠，開端電泳，當指示染料進入別離膠後，將電壓增加到80v/別離膠膠，持續電泳直至染料抵達距別離膠下端約1cm處，中止電泳，斷開電源。電泳時刻約1.0~1.5h。

（六）考馬斯亮藍染色

電泳結束後，取出電泳膠管，用長注射器針剝膠，一邊灌水一邊推膠，直至膠出。將膠移至大培養皿中，準確量取並記載凝膠長度和指示染料的搬遷間隔（別離膠上緣到染料條帶中間間隔），然後將凝膠板浸入考馬斯亮藍染色液中0.5-1h，再用脫色液脫色1~2天，至背景無色停止。區帶可作定性或定量剖析。

（七）校正曲線的數據處置和分子量測定  準確量取並記載染色後凝膠長度、各象征蛋白質和各待測蛋白質區帶的搬遷間隔（別離膠上緣到各蛋白質區帶中間）。按下式核算各蛋白質的相對搬遷率（Rm值）。

在半對數紙上，以各象征蛋白質的Rm值為橫坐標（一般標準），相應的分子量為縱坐標（對數尺刻度）作圖，即得分子量校正曲線。依據各待測蛋白質的Rm值，查此校正曲線，可求各待測蛋白質的相對分子量。

五、留意事項

1．製膠進程中用正丁醇封住膠麵是為了阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑製效果。

2．本法也適合於其他生物樣品中蛋白質的剖析。上樣量不宜過大，不然會呈現過載表象。尤其是考馬斯亮藍R250染色，在蛋白質濃度過高時，染料與蛋白質的氨基(－NH)構成的靜電鍵不安穩，其結合不符合Beer規律，使蛋白質量不準確。

3．Acr和Bis有神經毒性，可經肌膚、呼吸道等吸收，故操作時要留意維護。

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