聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟:
聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟作為檢測DNA序列差異的有效手段，變性凝膠電泳在我室廣泛使用，但是也有其使用範圍。在我室還有一種常用的非變性凝膠電泳技術，簡稱SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism，單鏈構象多態性）。
聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟原理：在SSCP測定中，雙鏈DNA（dsDNA）被變性成為單鏈DNA（ssDNA），每一條單鏈DNA都基於它們的內部序列而呈現出一種獨有的折疊構象，即使同樣長度的DNA單鏈因其堿基順序不同、甚至單個堿基的不同會形成不同的構象。這些單鏈DNA在非變性條件下，用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，單鏈DNA的遷移率和帶型，都取決於其折疊構象和電泳時的溫度。
SSCP與變性凝膠電泳基本一致，聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟不同之處有以下幾點：
a． SSCP使用非變性凝膠進行電泳，即在凝膠配製中不加入變性劑。我室常用8%非變性膠（丙烯酰胺 80g，N- N，-亞甲雙丙烯酰胺 2.76 g，10×TBE 50ml，加水定容到1L）
b． 工作環境，由於SSCP受溫度影響，所以在電泳過程中應防止溫度的升高，所以電泳環境為電壓400V，電流50mA，單板電泳功率為9W，不用預熱。緩衝液最好用新配製的。
c． 由於電泳功率較低，所以電泳時間較長，通常需要10小時以上，因此一般電泳需要過夜。室溫在25。C以下。
1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟
聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量的蛋白質，小於1kb的DNA片段和DNA序列。分析裝載的樣品容量大，可回收，DNA純度高。在催化劑TEMED（N-N-N，- N，-四甲基乙二胺）和過硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯劑，N- N，-亞甲雙丙烯酰胺的參與下，聚丙烯酰胺鏈與鏈之間交叉聯結形成凝膠。
1.1 配製30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g
N- N，-亞甲雙丙烯酰胺 1g
加水至100ML，40C棕色瓶可保存二月
1.2 配製5×TBE緩衝液：
TRIS堿 54克
硼酸 27.5克
EDTA 3.72克
加水至1L
1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟所用試劑體積
試劑
製備不同濃度聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟（%）凝膠所用試劑體積（ml）
3.5
5.0
8.0
12.0
20.0
30%丙烯酰胺
11.6
16.6
26.6
40.0
66.6
水
67.7
62.7
52.7
39.3
12.7
5×TBE
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
10%過硫酸銨
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
1.4 DNA在聚丙烯酰胺凝膠中有效分離範圍
丙烯酰胺（%）
有效分離範圍（bp）
二甲苯氰FF
溴酚藍
3.5
1000-2000
460
100
5.0
80-500
260
65
8.0
60-400
160
45
12.0
40-200
70
20
15.0
25-150
60
15
20.0
6-100
45
12
2. 聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟具體步驟
2.1從NaOH池中撈出浸泡的玻璃板，取出上麵的殘膠
2.2 把玻璃板拿到流動水處洗刷幹淨
2.3 洗幹淨的玻璃板至於玻璃板架上晾幹
2.4 用乙醇擦洗玻璃板
2.5 帶凹口的背板塗上矽化劑，麵板則塗上粘合劑，防止電泳完畢發生撕膠和脫膠的可能（塗摸要均勻）
2.6 麵板在下，背板在上。兩側用塑料板密封，並用夾子夾好。底部調節使之水平
2.7 將加入催化劑後的凝膠沿凹口均勻倒下，插入適當的封條。勿使封條下留下氣泡。用夾子夾緊封條部位
2.8 室溫聚合30分鍾，小心取出凹口處封條，用水衝洗加樣孔（否則封條所殘留的丙烯酰胺在加樣孔聚合產生不規則表麵，引起DNA帶變形）
2.9 將凝膠固定在電泳槽裏。帶凹口背板朝裏，麵向緩衝液槽
2.10 用0. 5×TBE灌滿電泳槽的緩衝液槽，接上電極，打開電源。調試工作環境為電壓2000-2200V，電流150-200mA，單板電泳功率為80W。預熱30分鍾左右。
2.11 點樣之前需切斷電源，用槍將點樣孔的氣泡及膠吹出，然後插入點樣梳，注意不要插得太深，否則點樣膠麵會變形，影響美觀及點樣。
2.12槍吸加樣品，PCR產物先加loading buffer 10ul ,再變性5分鍾左右，接著在冰水中冷卻5分鍾以上方可點樣，點樣完畢，電泳開始。
2.13 電泳至所需位置後，切斷電源，拔出導線，回收緩衝液，卸下玻璃板。在工作台上，將背板撬起，放回原處。將麵板進行銀染
3. 電泳後的銀染檢測
3.1 原理：
影像產生是由於核酸在膠上所占部位與周圍的氧化——還原勢不同而產生。銀染液中的銀離子（Ag+）可與核酸形成穩定的複合物，然後用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，這樣核酸電泳帶就染成了黑褐色。
3.2 銀染
銀染液的配製：稱2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水
銀染:將電泳完的麵板首先在銀染漂洗盆了漂洗趕緊，使膠麵上沒有異物。玻璃板反麵沒有汙染物。
將加入銀染液的銀染盆放在搖床上後，將麵板放入銀染1小時左右。
3.3 顯影
顯影液的配製：NaOH---20g, Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml
顯影：將麵板從銀染盆裏取出，在銀染漂洗盆裏漂洗，震蕩5-6次，取出後使其表麵盡量無水，再放入已加入顯影液的顯影盆裏（顯影，顯影液的配製及甲醛的加入都需要在通風櫥的搖床上進行）顯影過程大約10到15分鍾，以DNA條帶清晰可見為準。
將顯現完畢的板子在顯影漂洗盆裏漂洗後，方可讀帶。
本實驗室凝膠電泳相關常用試劑配方：
1. 我實驗室常用的聚丙烯酰胺凝膠是6%變性聚丙烯酰胺凝膠（簡稱變性膠，PAGE），就是在普通聚丙烯酰胺凝膠中加入變性劑。我們使用的變性劑是尿素。
6%PAGE具體配製方法為:
尿素210g，10×TBE 25ml ，丙烯酰胺28.5 g ，亞甲雙丙烯酰胺 1.5g，加水定容至500ml，過濾後使用。
考慮到方便使用的問題，一般一次配製2L（尿素840g，10×TBE100ml，丙烯酰胺114g，亞甲雙丙烯酰胺6g）。
2. 10×TBE（Tris-硼酸-EDTA）的配製
EDTA 7.44g，硼酸55g，Tris 108g，加水定容至1000ml
3. 10%過硫酸氨（AP）
10g過硫酸氨，純水定容至100ml
4. 矽化劑配方
二甲基二氯矽烷：無水乙醇=13ml：500ml
5. 反矽化劑（粘合劑）配製
無水乙醇 500ml（一瓶），44ddH2O，3.3冰醋酸，550ul Bind silnce（3，-Trimethoxysilyl propyl）
配置完遮光4。C保存
6 loading buffer 配製
0.1g 二甲苯氰，0.1g 溴酚藍，1ml 0.5molEDTA ，100mL甲酰胺
實驗試劑：
試劑貯備液：
1、 1mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加蒸餾水配成100ml，pH8.9。
2、 1mol/L HCl48ml，Tris5.98g，TEMED0.46ml，加蒸餾水配成100ml，pH6.7。
3、 Acr28g，Bis0.735g，加蒸餾水配成100ml。
4、 Acr10g，Bis2.5g，加蒸餾水配成100ml。
5、 核黃素4mg，溶於100ml蒸餾水中。
6、 蔗糖40g，加蒸餾水配成100ml。
7、 電極緩衝液：Tris6.06g，甘氨酸28.52g，加蒸餾水配成1000ml，pH8.3，用時稀釋10倍。
8、 過硫酸銨0.14g，加蒸餾水配成100ml。
9、 溴酚藍1mg溶於100ml蒸餾水中。
10、 脫色溶液：甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸餾水配成100ml。
11、 蛋白質染色液：考瑪斯藍G─250 200mg，甲醇100ml，冰醋酸20ml，蒸餾水80ml，溶解後混合之。
12、 過氧化物酶染色液：
1) 染色液甲：聯苯胺─抗壞血酸染色液，染色數分鍾。抗壞血酸70.4mg，聯苯胺溶液20ml（2g聯苯胺溶於18ml用文火加熱的冰醋酸中，再加蒸餾水72ml），0.6%過氧化氫20ml，蒸餾水60ml。
2) 染色液乙：聯茴香胺染色液，染色至少1小時。0.1mol/L醋酸緩衝液，pH5.5（0.82g醋酸鈉溶於80ml蒸餾水中，用醋酸調節至pH5.5，定容至100ml）。30%H2O20.25ml溶於50ml蒸餾水中，用時新鮮配製。鄰聯茴香胺（o─dianisidine）100mg，溶於100ml醋酸緩衝液(1)中。用時取溶液（2）5ml，溶液（3）50ml，混合之。
實驗步驟：
凝膠的製備：
1、 清洗幹淨兩塊玻璃板，晾幹後按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴而使聚丙烯酰胺液漏出。
2、 將裝好的玻璃電泳板傾斜成45～60℃角。把玻璃板在灌膠支架上固定好。
3、 分離膠：按1∶3∶8∶水=1∶2∶4∶1的比例，先將貯備液1，3和水放在一小燒杯中，過硫酸銨貯備液放在另一小燒杯中，一起放在真空幹燥器中，用真空泵抽氣15分鍾，取出將過硫酸銨溶液並入，用玻棒輕輕攪動使之混合，立即注於幹潔的玻璃板中。玻璃板垂直放置，用滴管吸取混合液，沿管壁注入，注意不要進入氣泡。膠液注到離玻璃板口2cm處，立即在其表麵覆蓋少量蒸餾水，靜置1小時左右，當見到水層下麵有一清晰的界麵時，則表明膠已聚合凝固，用吸水紙小心吸去上麵水層。
4、 濃縮膠：按2∶4∶5∶6=1∶2∶1∶4的比例，同上法製備濃縮膠，連續平穩加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳,靜置40分鍾。
電泳步驟：
1、 拔出樣梳後,在上槽內加入緩衝液,沒過鋸齒時可拆去底端的瓊脂糖。
2、 用微量注射器距槽底三分之一處進樣,加樣前,樣品在沸水中加熱3分鍾，去掉亞穩態聚合。
3、 電泳槽中加入緩衝液，接通電源，進行電泳，開始電流恒定在10mA，當進入分離膠後改為20mA，溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。
4、 凝膠板剝離與染色：電泳結束後，撬開玻璃板，將凝膠板做好標記後放在大培養皿內，加入染色液，染色1小時左右。
5、 脫色：染色後的凝膠板用蒸餾水漂洗數次，再用脫色液脫色，直到區帶清晰。
6、 實驗結果分析。
注意事項：
1、 固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板。
2、 凝膠配製過程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產生氣泡。
3、 水封的目的是為了使分離膠上延平直，並排除氣泡。
4、 凝膠聚合好的標誌是膠與水層之間形成清晰的界麵。
5、 樣梳需一次平穩插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。
6、 要使鋸齒孔內的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果。
7、 注射器不可過低,以防刺破膠體,也不可過高,在樣下沉時會發生擴散。
8、 為避免邊緣效應,最好選用中部的孔注樣.
9、 剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分。
變性:是指蛋白質被SDS變性。變性後，不同蛋白質的荷質比相同，在電泳的湧動速度隻跟分子量成正相關。
pAGE：既然濃度已經決定了 那麽凝膠形成的孔徑也就固定不變了。電泳中大分子跑的慢，小分子跑得快 因此蛋白質得以分離。
聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacryamide gel electropHoresis, PAGE)是由丙烯酰胺單體和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺在催化作用下形成的三維網狀結構物質。在不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳中，凝膠的製作是分層進行的，因此凝膠不僅有分子篩效應，還具有濃縮效應。和瓊脂糖凝膠相比，聚丙烯酰胺凝膠難於製備和處理。它們的分離範圍較窄。但是它們也有突出的優點，由於是不連續的pH 梯度，故樣品被壓縮成一條狹窄的區帶，因而增強了分離效果，提高電泳分辨率。尤其對小DNA 片段的分析(5～500bp)。在這一範圍內，僅差1bp 的DNA 分子也能清晰地分開。其次，DNA 純度很高。從聚丙烯酰胺凝膠中得到的DNA 純度很高以致於下步操作不用任何處理。還有，它的負載容量高。該膠的標準加樣槽中可以加入高達10mL 的DNA 樣品，而不影響電泳分辨率。多應用於分離純化和鑒定大小為5～500bp 的DNA 片段。聚丙烯酰胺凝膠電泳有連續與不連續體係兩種，前者指在整個電泳體係中的緩衝液pH 值和凝膠孔徑大小相同，主要用於核酸分析。後者主要用於蛋白質樣品的分離，它除了電泳槽中的緩衝體係和pH 值與凝膠中不同外，凝膠本身也由緩衝體係、pH 值和凝膠孔徑不同的兩種凝膠堆積而成。
聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳是以聚丙烯酰胺凝膠做支持物的一種區帶電泳，由於此種凝膠具有分子篩的性質，所以本法對樣品的分離作用，不僅決定於樣品中各組分所帶淨電荷的多少，也與分子的大小有關。其次，聚丙烯酰胺凝膠電泳還有一種獨特的濃縮效應，即在電泳開始階段，由於不連續pH 梯度的作用，將樣品壓縮成一條狹窄區帶，從而提高了分離效果。
聚丙烯酰胺凝膠具有網狀立體結構，很少帶有離子的側基，惰性好，電泳時，電滲作用小，幾乎無吸附作用，對熱穩定，呈透明狀，易於觀察結果。
聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯劑亞甲基雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在催化劑的作用下，聚合交聯而成的含有酰胺基側鏈的脂肪族大分子化合物。
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