今天來給大家介紹一下聚丙烯酰胺凝膠電泳配方：
聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N'-methylenebisacrylamide）聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有兩種：化學聚合和光聚合。聚丙烯酰胺凝膠電泳配方化學聚合通常是加入催化劑過硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過硫酸銨產生自由基：以R·代表自由基，M代表丙烯酰胺單體，這樣由於乙烯基"CH2=CH－"一個接一個的聚合作用就形成丙烯酰胺長鏈，同時甲叉雙丙烯酰胺在不斷延長的丙烯酰胺鏈間形成甲叉鍵交聯，從而形成交聯的三維網狀結構。氧氣對自由基有清除作用，所以通常凝膠溶液聚合前要進行抽氣。丙烯酰胺的另一種聚合方法是光聚合，催化劑是核黃素，核黃素在光照下能夠產生自由基，催化聚合反應。一般光照2－3小時即可完成聚合反應。
聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來控製，丙烯酰胺的濃度可以在3％－30％之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3％的聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質沒有明顯的阻礙作用，聚丙烯酰胺凝膠電泳配方可用於平板等電聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠，也可以用於分離DNA；高濃度凝膠具有較小的孔徑，對蛋白質有分子篩的作用，可以用於根據蛋白質的分子量進行分離的電泳中，如10％－20％的凝膠常用於SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠。聚合後的聚丙烯酰胺凝膠的強度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決於兩個重要參數T和C，T是丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺兩個單體的總百分濃度。C是與T有關的交聯百分濃度。T與C的計算公式是： C = 6.5－0.3T
上式中a為丙烯酰胺的克數，b為甲叉雙丙烯酰胺的克數，m為水或緩衝液體積（ml）。式中a與b的比例很重要。富有彈性，且完全透明的凝膠，a與b的重量比應在30左右。選擇T和C的經驗公式是：
此式可用於計算T為5％～20％時的凝膠組成。C值並不很嚴格，在大多數情況下，可變化的範圍約為 ±1％，當C保持恒定時，凝膠的有效孔徑隨著T的增加而減小，當T保持恒定，C為4％時，有效孔徑最小，C大於或小於4％時，有效孔徑均變大，C大於5％時凝膠變脆，不宜使用，實驗中最常用的C是2.6％和3％。
配成30％的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1個月，在貯存期間丙烯酰胺會水解為丙烯酸而增加電泳時的電內滲現象並減慢電泳的遷移率。聚丙烯酰胺凝膠電泳配方丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是一種對中樞神經係統有毒的試劑，操作時要避免直接接觸皮膚，但它們聚合後則無毒。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，因而可以得到較高的分辨率，尤其是在電泳分離後仍能保持蛋白質和酶等生物大分子的生物活性，對於生物大分子的鑒定有重要意義，其方法是在凝膠上進行兩份相同樣品的電泳，電泳後將凝膠切成兩半，一半用於活性染色，對某個特定的生物大分子進行鑒定，另一半用於所有樣品的染色，以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。
由於聚丙烯酰胺凝膠有突出的優點，因而四十年來得到廣泛的應用，目前尚無更好的支持介質能夠取代它。其主要的優點有：①可以隨意控製膠濃度"T"和交聯度"C"，從而得到不同的有效孔徑，用於分離不同分子量的生物大分子。②能把分子篩作用和電荷效應結合在同一方法中，達到更高的靈敏度：10－9 ～10－12 mol/L。③由於聚丙烯酰胺凝膠是由－C－C－鍵結合的酰胺多聚物，側鏈隻有不活潑的酰胺基－CO－NH2 ，聚丙烯酰胺凝膠電泳配方沒有帶電的其他離子基團，化學惰性好，電泳時不會產生"電滲"。④由於可以製得高純度的單體原料，因而電泳分離的重複性好。⑤透明度好，便於照相和複印。機械強度好，有彈性，不易碎，便於操作和保存。⑥無紫外吸收，不染色就可以用於紫外波長的凝膠掃描作定量分析。⑦還可以用作固定化酶的惰性載體。
聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質最初是在玻璃管中進行的，玻璃管通常直徑為7 mm，長10 cm，將凝膠裝入到多個管中進行電泳，又稱為柱狀電泳。目前仍有應用，尤其用於二維電泳中的第一維電泳。但由於各個玻璃管的不同以及裝膠時的差異使每管的分離條件會有所差異，所以對各管樣品進行比較時可能會出現較大誤差。後來發展起來的垂直平板電泳一次最多可以容納20個樣品，電泳過程中樣品所處的條件比較一致，樣品間可以進行更好的比較，重複性也更好，所以垂直平板電泳目前應用的更為廣泛，常用於蛋白質及DNA序列分析過程中DNA片段的分離、鑒定。
水平平板電泳近年來也有很快的發展，與垂直平板電泳相比也有其獨特的優點：①由於凝膠可以直接鋪在冷卻板上，容易使凝膠冷卻，因而可以加高電壓以提高分辨率。②電泳速度快，通常隻要1小時左右，而園盤電泳和垂直平板電泳一般需要3～4小時。③因為可以使用薄膠，加樣少，染色快，從而提高了靈敏度，而且容易保存，隻要用甘油浸泡後自然幹燥即可長期保存不會龜裂。④便於適用各種電泳方式，用途廣泛，尤其是可以使用90年代才發展起來的隻有水平電泳係統才能使用的新的半幹技術，即用浸有少量緩衝液的半幹的膠條代替通常所用的大量電極緩衝液，聚丙烯酰胺凝膠電泳配方大大節約了試劑，簡化了操作，提高了電泳速度。
聚丙烯酰胺凝膠電泳作為檢測DNA序列差異的有效手段，變性凝膠電泳在我室廣泛使用，但是也有其使用範圍。在我室還有一種常用的非變性凝膠電泳技術，簡稱SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism，單鏈構象多態性）。
原理：在SSCP測定中，雙鏈DNA（dsDNA）被變性成為單鏈DNA（ssDNA），每一條單鏈DNA都基於它們的內部序列而呈現出一種獨有的折疊構象，即使同樣長度的DNA單鏈因其堿基順序不同、甚至單個堿基的不同會形成不同的構象。這些單鏈DNA在非變性條件下，聚丙烯酰胺凝膠電泳配方用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，單鏈DNA的遷移率和帶型，都取決於其折疊構象和電泳時的溫度。
SSCP與變性凝膠電泳基本一致，不同之處有以下幾點：
a． SSCP使用非變性凝膠進行電泳，即在凝膠配製中不加入變性劑。我室常用8%非變性膠（丙烯酰胺 80g，N- N，-亞甲雙丙烯酰胺 2.76 g，10×TBE 50ml，加水定容到1L）
b． 工作環境，由於SSCP受溫度影響，所以在電泳過程中應防止溫度的升高，所以電泳環境為電壓400V，電流50mA，單板電泳功率為9W，不用預熱。緩衝液最好用新配製的。
c． 由於電泳功率較低，所以電泳時間較長，通常需要10小時以上，因此一般電泳需要過夜。室溫在25。C以下。
1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量的蛋白質，聚丙烯酰胺凝膠電泳配方小於1kb的DNA片段和DNA序列。分析裝載的樣品容量大，可回收，DNA純度高。在催化劑TEMED（N-N-N，- N，-四甲基乙二胺）和過硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯劑，N- N，-亞甲雙丙烯酰胺的參與下，聚丙烯酰胺鏈與鏈之間交叉聯結形成凝膠。
1.1 配製30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g
N- N，-亞甲雙丙烯酰胺 1g
加水至100ML，40C棕色瓶可保存二月
1.2 配製5×TBE緩衝液：
TRIS堿 54克
硼酸 27.5克
EDTA 3.72克
加水至1L
1.3 製備聚丙烯酰胺凝膠所用試劑體積
試劑
製備不同濃度（%）凝膠所用試劑體積（ml）
3.5
5.0
8.0
12.0
20.0
30%丙烯酰胺
11.6
16.6
26.6
40.0
66.6
水
67.7
62.7
52.7
39.3
12.7
5×TBE
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
10%過硫酸銨
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
1.4 DNA在聚丙烯酰胺凝膠中有效分離範圍
丙烯酰胺（%）
有效分離範圍（bp）
二甲苯氰FF
溴酚藍
3.5
1000-2000
460
100
5.0
80-500
260
65
8.0
60-400
160
45
12.0
40-200
70
20
15.0
25-150
60
15
20.0
6-100
45
12
2. 聚丙烯酰胺凝膠電泳具體步驟
2.1從NaOH池中撈出浸泡的玻璃板，取出上麵的殘膠
2.2 把玻璃板拿到流動水處洗刷幹淨
2.3 洗幹淨的玻璃板至於玻璃板架上晾幹
2.4 用乙醇擦洗玻璃板
2.5 帶凹口的背板塗上矽化劑，麵板則塗上粘合劑，防止電泳完畢發生撕膠和脫膠的可能（塗摸要均勻）
2.6 麵板在下，背板在上。兩側用塑料板密封，並用夾子夾好。底部調節使之水平
2.7 將加入催化劑後的凝膠沿凹口均勻倒下，插入適當的封條。勿使封條下留下氣泡。用夾子夾緊封條部位
2.8 室溫聚合30分鍾，小心取出凹口處封條，用水衝洗加樣孔（否則封條所殘留的丙烯酰胺在加樣孔聚合產生不規則表麵，引起DNA帶變形）
2.9 將凝膠固定在電泳槽裏。帶凹口背板朝裏，麵向緩衝液槽
2.10 用0. 5×TBE灌滿電泳槽的緩衝液槽，接上電極，打開電源。調試工作環境為電壓2000-2200V，電流150-200mA，單板電泳功率為80W。預熱30分鍾左右。
2.11 點樣之前需切斷電源，用槍將點樣孔的氣泡及膠吹出，然後插入點樣梳，注意不要插得太深，否則點樣膠麵會變形，影響美觀及點樣。
2.12槍吸加樣品，PCR產物先加loading buffer 10ul ,再變性5分鍾左右，接著在冰水中冷卻5分鍾以上方可點樣，點樣完畢，電泳開始。
2.13 電泳至所需位置後，切斷電源，拔出導線，回收緩衝液，卸下玻璃板。在工作台上，將背板撬起，放回原處。將麵板進行銀染
3. 電泳後的銀染檢測
3.1 原理：
影像產生是由於核酸在膠上所占部位與周圍的氧化——還原勢不同而產生。銀染液中的銀離子（Ag+）可與核酸形成穩定的複合物，然後用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，這樣核酸電泳帶就染成了黑褐色。
3.2 銀染
銀染液的配製：稱2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水
銀染:將電泳完的麵板首先在銀染漂洗盆了漂洗趕緊，使膠麵上沒有異物。玻璃板反麵沒有汙染物。
將加入銀染液的銀染盆放在搖床上後，將麵板放入銀染1小時左右。
3.3 顯影
顯影液的配製：NaOH---20g, Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml
顯影：將麵板從銀染盆裏取出，在銀染漂洗盆裏漂洗，震蕩5-6次，取出後使其表麵盡量無水，再放入已加入顯影液的顯影盆裏（顯影，聚丙烯酰胺凝膠電泳配方顯影液的配製及甲醛的加入都需要在通風櫥的搖床上進行）顯影過程大約10到15分鍾，以DNA條帶清晰可見為準。
將顯現完畢的板子在顯影漂洗盆裏漂洗後，方可讀帶。
本實驗室凝膠電泳相關常用試劑配方：
1. 我實驗室常用的聚丙烯酰胺凝膠是6%變性聚丙烯酰胺凝膠（簡稱變性膠，PAGE），聚丙烯酰胺凝膠電泳配方就是在普通聚丙烯酰胺凝膠中加入變性劑。我們使用的變性劑是尿素。
6%PAGE具體配製方法為:
尿素210g，10×TBE 25ml ，丙烯酰胺28.5 g ，亞甲雙丙烯酰胺 1.5g，加水定容至500ml，過濾後使用。
考慮到方便使用的問題，一般一次配製2L（尿素840g，10×TBE100ml，丙烯酰胺114g，亞甲雙丙烯酰胺6g）。
2. 10×TBE（Tris-硼酸-EDTA）的配製
EDTA 7.44g，硼酸55g，Tris 108g，加水定容至1000ml
3. 10%過硫酸氨（AP）
10g過硫酸氨，純水定容至100ml
4. 矽化劑配方
二甲基二氯矽烷：無水乙醇=13ml：500ml
5. 反矽化劑（粘合劑）配製
無水乙醇 500ml（一瓶），44ddH2O，3.3冰醋酸，550ul Bind silnce（3，-Trimethoxysilyl propyl）
配置完遮光4。C保存
6 loading buffer 配製
0.1g 二甲苯氰，0.1g 溴酚藍，1ml 0.5molEDTA ，100mL甲酰胺
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