聚丙烯酰胺降解細菌的篩選及降解特性:
聚丙烯酰胺降解細菌的篩選及降解特性,聚丙烯酰胺是一種線性高分子化合物，已被應用於石油開采、造紙、農業、水處理、醫 藥、紡織印染等領域。但是聚丙烯酰胺在環境中存留，會改變土壤和水體的理化性質，影響 水體的COD。聚丙烯酰胺在特殊條件下會發生緩慢降解，其降解後產生的丙烯酰胺（AM) 單體具有很強的生物毒性，會導致人體器官功能和粘膜受損，甚至會導致中樞神經係統受到 損傷。因此，環境中聚丙烯酰胺的降解將成為環境保護者重要關注和研究的課題。
大量研究表明，微生物降解聚丙烯酰胺是消除其引起的環境汙染和潛在毒性的有效手段。 由於細菌生長快速，適應性強，如今利用微生物降解聚丙烯酰胺主要集中在細菌上。本研究 采用平板脅迫法，從生產聚丙烯酰胺的大慶市化工廠廠區土壤和排水溝泥水中分離篩選出降 解聚丙烯酰胺的細菌，並進行分子生物學鑒定。同時研究其生長和降解特性，並進一步考察 複合菌的協同作用、降解特性及不同碳氮源對複合菌降解的影響情況。為降解聚丙烯酰胺提 供菌源，為生物處理聚丙烯酰胺汙染水體提供技術支持。試驗獲得的結果如下：
1.試驗采用平板脅迫法篩選出3株高效降解菌，初步鑒定為：PAMB3為枯草芽孢杆菌
PAMB7為地衣芽抱杆菌削/5〇; PAMB8為解澱粉芽抱 杆菌（_6如//^〇撕少/〇//糾咖咖《5〇。PAMB3僅能以聚丙烯酰胺為唯一氮源生長；PAMB7和 PAMB8可以聚丙烯酰胺為唯一碳源、唯一氮源和唯一碳氮源生長。
2. 以聚丙烯酰胺為唯一氮源時，PAMB3適宜在環境溫度25〜40 °C、底物濃度為200〜 700 mg.L-1、pH值為6〜11生長和降解；在最佳條件30 °C、500 mg.L-1聚丙烯酰胺、pH值 為9.0下，對聚丙烯酰胺降解率為45.1 %。PAMB7適宜在環境溫度25〜35 C、底物濃度為 50〜700 mg.L-1、pH值為6〜11生長和降解；在最佳條件30 C、500 mg.L-1聚丙烯酰胺、pH 值為8下，對聚丙烯酰胺降解率為39.9 %。PAMB8適宜在環境溫度25〜35 C、底物濃度為 100〜700 mg.L-1、pH值為7〜10生長和降解；在最佳條件35 C、500 mg.L-1聚丙烯酰胺、 pH值為9下，對聚丙烯酰胺降解率為36.2 %。
3.在組合降解實驗中PAMB3+PAMB7+PAMB8複合菌（PB378)和PAMB3+PAMB7複 合菌（PB37)降解效果最好。PB378和PB37降解的適合條件是初始聚丙烯酰胺濃度為50〜 1 000 mg.L-1，20〜40 °C„PB378初始pH值範圍為5〜12, PB37適合的初始pH值範圍為5〜 11。PB378和PB37在最佳條件溫度為30 C、底物濃度為700 mg-L-1、pH值分別為9和8 時，對聚丙烯酰胺的降解率分別為58.2 %和57.1 %。
4.不同碳氮源對複合菌降解影響的試驗表明，NH4CI、NH4NO3對聚丙烯酰胺降解率分 別為60.88 %、60.43 %和58.83 %、59.49 %;石油對複合菌的生長和代謝無明顯影響。但尿 素、牛肉膏和蛋白腖對PB378和PB37降解聚丙烯酰胺具有競爭代謝作用，聚丙烯酰胺降解 率很低。
含聚丙烯酰胺石油采出廢水多為堿性，且含有石油，PB378和PB37均適宜石油采出廢 水中聚丙烯酰胺的降解。二者降解能力差異較小，建議實際中采用PB378。
研究目的與意義
聚丙烯酰胺（Polyacrylamide，PAM)，是一種線性高分子化合物，具有增稠性、絮凝性、 減阻性、耐剪切性、泥漿處理劑、分散性、淨化性、增粘性、沉降性、助留性等[1]。已廣泛 應用於多個領域[2]，是應用最廣泛的水溶性高分子化合物之一 [3,4]。
近年來，由於我國多數陸地主力油田已進入中後期開發階段，聚合物驅油技術已經成為 目前應用最廣泛的三次采油技術，而且聚丙烯酰胺是聚合物驅油中最常用的物質[5,6]。據相關 資料表明，在我國石油儲量中有43.6Xl05kt可大規模使用聚合物驅油技術來提高采收率，如 按平均提高采收率8.6 °%計算，能增加可采石油儲量3.8Xl05 kt，需要聚合物2.24Xl05 kt[7]， 到2010年，聚合物驅油已占聚丙烯酰胺消耗總量的81 %[8]。在三次采油的過程中應用聚合 物驅油技術，在采油過程中將聚丙烯酰胺注入油層，使油/水間流度比下降，使水的粘性指數 降低，從而提高是油采收率。
但聚丙烯酰胺會改變油/水混合物的性質，使原油乳化，導致水中含油量和粘度增加，且 汙水成分複雜難以降解；同時聚丙烯酰胺的用量和應用範圍正呈現快速增長的趨勢，其在環 境中的累積、遷移、轉化和降解產生的單體丙烯酰胺（AM)會對人和動物周圍神經係統產 生永久的、不可修複的損害[9]，並將給生態環境帶來長期不可估量的危害，因此處理含聚丙 烯酰胺汙水的研究已經迫在眉睫[10]。到目前為止，對含聚丙烯酰胺廢水處理的手段主要有物 理處理法、化學處理法和生物降解法等。其中生物降解法是目前最常用的降解聚丙烯酰胺的 方法，這是由於生物降解方法可將聚丙烯酰胺降解具有對環境友好的小分子有機物和無機物、 處理成本低、可進行原位異位處理等優點[11]。
本研究從生產聚丙烯酰胺的大慶市化工廠廠區土壤和溝渠泥水中分離篩選出降解聚丙烯 酰胺的細菌，並進行群落特征、生理生化特征、16SrRNA方法等鑒定。研究其生長和降解特 性。本研究可為降解聚丙烯酰胺提供菌源，為實現聚丙烯酰胺汙染的水體生物處理提供技術 支持和理論依據。
1.2聚丙烯酰胺的概述
1.2.1聚丙烯酰胺的性質與分類
1.2.1.1聚丙烯釀胺的性質
(1)物理性質
聚丙烯酰胺是白色粉狀物質，為線性水溶性高分子化合物，其分子結構單元中含有親水 基酰胺基，溶於水中易形成氫鍵，在水溶液中分子呈團狀，能以各種比例溶於水，但幾乎不
溶於多數有機溶劑，水溶液為透明的粘稠液體，固體聚丙烯酰胺有較高的吸濕性。聚丙烯酰
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胺本身是非危險品，無毒、無味、無腐蝕性。是應用最廣泛的水溶性高分子化合物之一[12]。 按形狀可分為粉狀、膠體、乳濁液和水溶液，按分子量又可以分為高分子量（1 000萬以上）、 中分子量（100萬〜1 000萬）、低分子量（100萬以下）。
(2)化學性質
聚丙烯酰胺是丙烯酰胺及其衍生物的均聚物和共聚物的統稱。其分子結構如下：
一 CH2—CH—CH2—CH—CH〗一CH—
I I I
CONH2CONH2CONH2
化學性質主要表現為分子鏈斷裂降解反應和酰胺基的化學反應[13]。主要體現在水解性、 分散性、絮凝性。受酰胺基的影響，聚丙烯酰胺分子還可發生霍夫曼降解反應、曼尼希反應、 磺甲基化反應和氫甲基化等，生成各種聚丙烯酰胺衍生物。
1.2.1.2聚丙烯釀胺的分類
根據電荷性質可將聚丙烯酰胺分為非離子型聚丙烯酰胺（NPAM)、陰離子型聚丙烯酰胺 (APAM)、陽離子型聚丙烯酰胺（CPAM)和兩性聚丙烯酰胺（AmPAM) [14]。
1.2.2聚丙烯酰胺的應用與危害
1.2.2.1聚丙烯釀胺的應用
聚丙烯酰胺是一種化學性質比較活潑大分子物質。其側鏈上的酰胺基活性較強，能發生 多種化學反應並獲得多種衍生物，正是這些的性能使其在水處理、石油開采、造紙、紡織印 染、洗煤、選礦、醫藥、養殖、製糖、農業、建材等行業都具有應用廣泛[15]，而且近年來聚 丙烯酰胺也應用在食品、藥品[16]以及整容等與人類健康和日常生活相關的領域[17]。其消耗結 構為：石油開采工業占總需求量的80 %左右，水處理約占9 %，造紙業占5 %，礦業占2 %， 其它占3 %[18]。據報道，1997年世界年需求量為65萬噸[19]，到了 2008年世界聚丙烯酰胺消 費量已達到84萬t[20]。聚丙烯酰胺最早於1893年由德國科學家Moureu合成，1952年由美 國道化學公司於申請專利權，並於1954年開始工業生產。我國第一條聚丙烯酰胺生產線於 1966年由蘭州白銀有色金屬公司建立[21]。2005年，我國市場共需聚丙烯酰胺14.2萬噸[22]。
(1)在石油開采中的應用
在石油開采中，聚丙烯酰胺主要被用作鑽井泥漿材料以及提高石油采收率，被廣泛應用 於鑽井、完井、固井、壓裂和強化采油等油田開采作業中，具有流變調節、增粘、剖麵調整、 膠凝、分流等功能[23’24]。
最早於20世紀50年代末聚丙烯酰胺開始應用於石油開采方麵[25]，主要用於石油勘探與 開采的泥漿添加劑和選擇性堵水劑等。在分離提取石油時使用聚丙烯酰胺產品，可使才有率 提高20 %〜50 %。在一些發達國家進行了大量聚合物驅油工業化試驗，結果表明，聚合物驅
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油一般可使石油采收率提高6 %〜17 %，在我國三次采油技術已成為聚丙烯酰胺應用的最大 領域[26]。聚合物驅油技術適用於我國石油開采，經過多年的研究，目前，該技術已在油田進 行大範圍工業化推廣，而且驅油效果較好。在我國三次采油技術已得到大範圍的推廣，並且 其技術己達到世界領先水平。
為了減少采出水對環境的汙染、淡水資源的浪費和回收采出水中的石油，為提高社會效 益和經濟技益，多數情況下降經處理的采出水回注於油層。在油田開發的不同時期采出水處 理，均占有著重要的地位。伴隨油田的發展，油田開發已進入的不同時期，油田采出水處理 方法可分為三個階段。
第一階段：在油田開發初期，為含水量低時的水處理階段。此階段石油開采時利用天然 能量的階段。石油被覆蓋於石油層上的岩石對其所處的地層及流體的壓力擠壓下經油井出口 到達地麵。隨著原油及天然氣的產出，油層岩石與流體體積比變大，使彈性勢能也逐漸釋放。
第二階段：從1991年開始該階段，油田中石油含水量由低逐步變大。此階段主要針對處 理後達高滲透的油層，通過注氣或注水等方法向油層補充能量，提高油層壓力。通過以上方 法可提高油層壓力，以提高地層中的岩石和流體的彈性勢能，建立新的壓力差，從而采出僅 靠天然能量不可采出的石油。但由於地層性質非均勻，注入的流體會沿阻力最小的方向流動， 使阻力相對較大區域的石油無法被驅替出來，即使是被注入流體流過的區域，也依然存在一 定數量石油，由於岩石的吸附作用無法被采出。另外，部分石油無法多孔介質中流動，所以， 二次采油雖能提高采油效率，但能力有限。
第三階段：從1997年設計建站開始，是聚驅開采時期的采出水處理階段。在該階段，通 過各種物理、化學方法，來改變油層流體和油層之間的粘度，增加石油的流動能力，驅替油 層中不連續和難於開采石油，從而使石油隨著添加物質共同采出。主要原理是應用化學物質、 蒸氣、添加劑或微生物等注入油層，使油水混合界麵性質或原油本身物化性質改變[27]。該方 法所添加聚合物的主要成分為聚丙烯酰胺類。
聚合物驅油是將一定量相對分子量較高的聚合物注入水中，增加黏度改變流度比。由於 含聚丙烯酰胺的注入水黏度較高，通過油層時有較高殘餘阻力係數。隨著黏度的升高，殘餘 阻力係數會變大，使驅替相的流度隨之便小，導致驅替相與被驅替相的流度減小，聚合物對 油層宏觀和微觀波及效率的擴大作用就會隨之增大，由此使采收率提高[28]。目前應用的水溶 性聚合物主要有生物聚合物和聚丙烯酰胺類聚合物。近年來丙烯酰胺多元共聚物迅速發展， 使之成為20世紀80年代發展起來的重要油田處理劑之一[29]。
(2)在農業中應用
我國是世界上水土流失較嚴重的國家之一[30,31]，現有水土流失麵積約為356萬hm2,約 占總麵積的37 %[32-34]。水土流失嚴重破壞耕地質量，嚴重威脅農業可持續發展。長期以來， 大量學者進行多種試驗研究，期望能夠以保持糧食產量為前提的基礎上減少水土流失。其中， 應用聚丙烯酰胺作為堵水劑改良土壤結構，已經廣泛應用於農業土壤改良。眾多研究[35,36]表 明：聚丙烯酰胺不但能有效地維持土壤團粒體的結構，還能形成新的團聚體，聚丙烯酰胺溶 於水所產生的黏聚作用力可有效地緩解雨水對表麵土壤的打擊並抑製土壤結皮的形成，使土 壤入滲能力增加，減少地表徑流，從而減少水土流失。此外，聚丙烯酰胺還可以改善土壤的
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物理結構，從而影響土壤中養分的遷移。
聚丙烯酰胺可作為保水劑，削弱降水入滲。大量研究表明，應用聚丙烯酰胺作為土壤結 構改良劑，可以增加表層土壤顆粒間凝聚力，以維持良好的土壤結構，防止土壤表層結皮， 使土壤入滲率增加[37]。由於聚丙烯酰胺具有很強的吸水性和保水能力，可同時減少地表徑流、 防止土壤流失[38]，並能較好抑製土壤水分蒸發這一水循環的重要環節，從而使幹旱半幹旱地 區生態環境得到改善。楊永輝[39]等研究發現：當土壤含水量一定時，加如聚丙烯酰胺可抑製 土壤中水分的蒸發。此外，聚丙烯酰胺的親水基團可吸附水分子，減少水分損耗。經聚丙烯 酰胺處理的土壤水分狀況也會發生變化，隨著聚丙烯酰胺施用量增加土壤凋萎係數也隨之增 加，但增幅不大，土壤中毛細管持水量大幅度增加，使有效水貯量增大[40]，使植物因受水分 脅迫到達萎蔫狀態的時間延遲。林文傑[41]等使用德國Stock — hausen公司生產的保水劑對石 楠苗木進行盆栽試驗，研究結果表明，施加保水劑延長石楠苗木生存期，並隨著土壤中保水 劑用量增加，延長的時間也會增加。
聚丙烯酰胺也是一種有效的土壤結構穩定劑。加入聚丙烯酰胺的土壤能夠更好地抵禦雨 水的侵蝕，隨著加入聚丙烯酰胺量的增加被侵蝕土壤數量隨之減少[42]。王輝等經試驗發現： 土壤中加入聚丙烯酰胺可減少速效鉀、速效磷和硝態氮的流失，減少流失量分別為95 %、95% 和78 %[43]，而且加入聚丙烯酰胺後土壤侵蝕量會降低，因此隨土壤流失的養分也會大大減少， 所以利用聚丙烯酰胺來限製營養物質遷移可以在一定程度上減緩水體富營養化的進程。大量 研究發現，聚丙烯酰胺影響土壤中磷和鉀遷移的一個主要因素是降雨強度[44]。產生這種差異 主要原因是土壤中加入聚丙烯酰胺後低強度降雨可抑製土壤表層入滲，從而減少表層土壤因 淋溶而失去的養分，但會使表層土壤養分隨徑流流失量增加；暴雨條件下，土壤中施加的聚 丙烯酰胺可使土壤被侵蝕的可能性降低，減少在雨水侵蝕和地表徑流衝刷作用下表層土壤的 流失，同時避免地表徑流引起的下層土壤養分流失。此外，土壤中施加聚丙烯酰胺還可影響 坡地土壤水分的再分布，減少土壤水分向深層滲漏，從而降低土壤中養分淋失風險[44]。此外， 聚丙烯酰胺還可作為土壤結構改良劑，可以改變土壤中氣體的交流、熱量平衡、微生物活動 和植物根係發展，同時還會影響土壤中生物所需養分和水分的儲量和供應能力。
因此，應用聚丙烯酰胺提高土壤入滲能力、防治水土流失[45]具有很廣闊的前景。
(3)水處理中的應用
由於聚丙烯酰胺具有良好的絮凝性，目前仍是國內外水處理領域中應用最廣泛的處理劑 [46]。以聚丙烯酰胺作為有機絮凝劑與活性炭等配合使用，應用在在原水處理中，可提高淨水 能力；聚丙烯酰胺也可作為配方藥劑應用在工業水處理中；在汙水處理中，由於其良好的吸 水性，聚丙烯酰胺可用於汙泥脫水；在汙水處理中，加入聚丙烯酰胺可增加水回用循環的使 用效率[47]。
(4)在礦業、冶金的應用
聚丙烯酰胺在礦業、冶金工業的主要應用涉及過程為選礦、采礦和冶金[48]。聚丙烯酰胺 可促進回收水中固體物質沉降，使水澄清，同時回收有用固體顆粒物，既可降低水資源的消 耗，又可提高生產效率，減少尾礦流失，降低生產成本，同時避免重工業對環境造成汙染；
(5)在紡織業的應用
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聚丙烯酰胺在紡織工業中，常被用作織物的上漿劑和整理劑[49]，可在織物的表麵形成保 護層；因其具有良好的吸水性、成膜性和纖維親和性，可以有效減少紡細紗斷線率；同時其 作為後處理劑使用可以阻燃和防止織物的靜電；作為印染助劑使用，還可提高產品鮮豔程度； 此外，還可用於紡織印染汙水的淨化[50]。
(6)在造紙業的應用
聚丙烯酰胺被廣泛用於造紙領域中。首先可提高紙張的抗撕扯性和多孔性；其次可以有 效提高填料、細小纖維、顏料等的存留率，並且加快紙張脫水速率，降低原料流失，降低造 紙業對環境的汙染；再次可減小纖維絮凝、提高紙張柔和性、均勻性。此外，聚丙烯酰胺還 可應用於造紙業中紙纖維的回收[51]。
(7)其它
聚丙烯酰胺還可以被用於粘合劑、沙漠改良劑、增稠劑、潤滑劑、臘紙上臘、電池極間 填漿等。例如，在幹電池中加入聚丙烯酰胺，可有效防止電池發黴、變質、漏電，還可縮小 電池體積，增大容量。適用於地質鑽井作業中，可使鑽頭到充分潤滑，使其使用壽命延長20% 以上，同時可使鑽井速度加快。在養殖業中，可有效改善水質，增加水體透光性，從而改善 水生植物光合作用；在醫藥業中，可用於廢水澄清劑等；在建材業中，可用作塗料增稠分散 劑、陶瓷粘接劑以及鋸石板材冷卻劑等；在建築業中，聚丙烯酰胺可用於增強水泥硬度。此 外，聚丙烯酰胺還可作為作天然或合成皮革保護塗層及無機肥料造粒助劑等[52]。
1.2.2.2聚丙烯釀胺的危害
聚丙烯酰胺可應用在許多領域，其最終歸屬進入環境中，含聚汙水不但會改變土壤和水 體的理化性質，而且聚丙烯酰胺本身對水體COD也有一定影響。聚丙烯酰胺的降解性、遷 移轉化、地層吸附性及其降解產物對環境的潛在危害也越來越嚴重。
首先，聚丙烯酰胺在土壤中的行為主要有：揮發、擴散、吸附、解吸、降解、遷移等。 土壤是生態係統中重要組成部分之一，是一個固-液-氣-生物構成的多介質複雜體係，是人類 賴以生存和發展的物質基礎和環境條件，是汙染物吸附、降解等行為發生最為繁雜的場所。 聚丙烯酰胺雖然可以有效減少土壤侵蝕，但其本身進入土壤後提高了土壤的化學需氧量 (COD)，另外由於物理、化學、光化學和生物過程，使聚丙烯酰胺以每年至少10 %的速率 降解，產生的代謝產物具有極強的生物毒性。當土壤中所帶與聚丙烯酰胺不同電荷較少時， 單獨施用聚丙烯酰胺，不僅會使土壤表麵吸附的聚丙烯酰胺量較少，而且使聚丙烯酰胺分子 鏈變長，長鏈聚丙烯酰胺分子會堵塞土壤氣孔。
其次，使用聚丙烯酰胺在提高石油采收率的同時，大部分含聚丙烯酰胺水溶液進入油層， 致使汙水滲透進入地下水層，且使得聚丙烯酰胺在地表和地下水體中長期滯留，導致水環境 受到威脅。
當今，對聚丙烯酰胺驅油的研究已成為各國的研究熱點，且三次采油技術也日趨成熟。 然而聚丙烯酰胺產生的危害也日益受到重視[53]。聚丙烯酰胺可以提高油田采收率，但同時我 們逐漸了解到其對地麵工程也有相當惡劣的影響[54]，采出水對環境也會造成巨大危害。與普 通水驅汙水比較，含聚汙水黏度高，對乳化油滴具有穩定作用，會導致生產井及注聚井易被
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腐蝕、結垢，而且地層易堵塞等問題產生。聚丙烯酰胺分子在油滴表麵形成的空間位阻礙油 滴接觸、聚並，使小油滴更穩定存在於水中。聚丙烯酰胺吸附在油水界麵上，使界麵膜強度 增大，使破乳更加困難，增加了油水分離的難度，使采出水含油量嚴重超標[55]。此外在采油 作業中，需配製大量聚丙烯酰胺溶液，進入地層的聚丙烯酰胺會滲入地下水層。由此可以看 出應用的聚丙烯酰胺會同時汙染地表、地下水體，聚丙烯酰胺在水體中長期滯留，會對采油 地區水環境造成巨大的危害[56]。
最後，聚丙烯酰胺本身無毒，但在特殊條件下會發生緩慢降解，其降解後產生的丙烯酰 胺（AM)單體[57]毒性很大[58]，國內外已有大量研究者對其毒性進行研究。丙烯酰胺是一種 急性的眼、呼吸道、皮膚刺激物，可通過多種途徑進入人體，並引起皮膚過度角質化、濕疹、 脫屑、牛皮癬等[59];另外，丙烯酰胺還可導致人體器官功能受損[60]。高等動物吸收一定量丙 烯酰胺，將導致中樞神經係統受到損傷[60]，甚至發生病變[61,62]，通常以周圍神經和脊髓神經 的上行傳導束的感覺、運動、自主神經功能受到破壞為標誌。在接觸丙烯酰胺職業人群的流 行病觀察表明，長期接觸低劑量丙烯酰胺會出現情緒和記憶改變、嗜睡、震顫和幻覺等症狀， 伴隨末梢神經病變（出汗、手套樣感覺和肌肉無力）[63]。丙烯酰胺已於1959年被美國環保 局歸為B類疑似致癌物，有充足動物致癌證據但缺少足夠人類致癌證據[64]。動物試驗結果表 明，丙烯酰胺能引起基因突變，損傷生物DNA結構，生成新的DNA加合物，還可使染色體 畸變，甚至影響胚胎的發育，並且對內髒等重要器官具有較嚴重的毒性[65,66]。
對於丙烯酰胺在環境中存在的濃度各國均有相應法律法規：美國職業安全與衛生法 (OSHA)規定職業丙烯酰胺接觸標準為空氣中丙烯酰胺閾值-時間加權平均值為0.3 mg.m-3 [67];英國規定丙烯酰胺在飲料中含量< 0.25X10-6g.L-1 [68];日本規定排放丙烯酰胺含量<10 X10-6g.L-1;在我國費渭泉等提出，丙烯酰胺排入水體中剩餘濃度< 10X10-6g.L-1[69]。
因此，聚丙烯酰胺的降解特性是使用者和環境保護者一直關注和研究的課題。
1.3聚丙烯酰胺在汙水中的處理方法
由於聚丙烯酰胺分子量較大且結構穩定，長期以來一直被認為是安全和難於降解的，有 關其在自然界中的降解及其毒理的報道也是在20世紀90年代首先由SmithE[70]提出的。自 然條件下，聚丙烯酰胺會發生緩慢的物理降解（熱、機械）[71]、化學降解（水解、氧化以及 催化氧化）[72]和微生物降解[72-74]，在相當長的時間內，聚丙烯酰胺還將被廣泛的應用在各個 領域。其毒性亦將逐漸顯露出來，並將給生態環境帶來不可估量的危害。因此，長期以來尋 找一種高效降解聚丙烯酰胺的方法一直是聚丙烯酰胺使用者和環境保護者研究的課題。到目 前為止，對含聚丙烯酰胺廢水處理的手段主要有物理處理法、化學處理法和生物降解法等。
1.3.1物理方法
物理法處理技術即采油中含聚汙水的預處理，采油汙水在沉降罐中經自然沉降，去除浮 油及大顆粒雜質，經粗粒化後，進行二次沉降並且過濾，除去細小油滴及未沉降的懸浮物。 使用單純的沉降方法處理含聚汙水根本達不到油田回注水的指標，常用處理含聚汙水的物理
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方法有機械降解、絮凝沉澱法、熱降解、超聲技術和激光脈衝技術。
1.3.1.1機械降解
機械降解是應用械能引發的聚合物鏈反應，破壞其分子機構的過程。研究表明，通過機 械作用即使聚丙烯酰胺粘度降低，其平均分子量也可能幾乎不變，這可能因為聚合物的鏈和 分枝再形成的原因。當鈣離子存在於聚丙烯酰胺溶液中時，則能促進其降解。邵振波[75]等發 現在剪切速率到達4 000 s-1前，聚丙烯酰胺分子鏈隻發生輕微降解，在剪切速率達到5 000 s-1 時，聚丙烯酰胺則會發生大幅降解，重均分子量、數均分子量隻有母液的1/4左右。
1.3.1.2絮凝沉澱去除法
絮凝沉澱是去除汙水中聚丙烯酰胺較常用的方法之一。徐蘇欣等[76]對篩選出兩種絮凝劑 XN-III和XN-IV進行研究。結果表明，隨采汙水pH值增加，聚丙烯酰胺的絮凝效果會變差。
1.3.1.3熱降解
熱降解是指在熱作用下使聚丙烯酰胺化學鍵斷裂的過程。室溫下，聚丙烯酰胺水溶液比 較穩定，隨著溫度的升高聚丙烯酰胺就會發生明顯的降解現象。實驗結果[77]表明，在溫度為 50 °C時，隨時間增加，聚丙烯酰胺粘度降解率明顯下降，而粘度降解率下降的趨勢隨緯度的 升高而增加。Silva通過對聚丙烯酰胺和聚丙烯酰胺的N取代烷基衍生物的失重曲線進行比 較認為，聚丙烯酰胺在升溫過程中共發生了兩次降解，其反應溫度分別為326 C和410 C， 第一次降解主要是相鄰酰胺基相互縮合，脫氨基形成酰亞胺的過程；第二次的降解過程主要 是脫氫、形成二氧化碳，已利用色譜儀分析了降解後的氣相組成，並證明產生了氨氣[78]。 Yang[79]則進一步根據不同的熱重曲線計算出了兩次降解過程活化能分別為137.1 kJ.mol-1和 190.6 kJ- mol-1。
1.3.1.4超聲波降解
Hsrng — Yuan Yen等[80]運用超聲波技術以不同反應溫度、照射時間為條件，研究不同濃 度聚丙烯酰胺溶液的講解情況及粘度降解情況，研究結果表明，超聲波對聚丙烯酰胺的降解 效果於溫度成正比，與濃度成反比。
1.3.1.5激光脈衝技術
印度的S. P. Vijayalakshmi等[81]運用激光脈衝技術降解聚丙烯酰胺。結果表明，氧氣 是使聚丙烯酰胺主鏈斷開的必須條件之一，聚丙烯酰胺降解的第一步為水分子被光激化，產 生羥基，第二步則是聚合物脫氫反應。聚丙烯酰胺的降解程度與激光強度成正比。
1.3.2化學方法
近年來，環境保護者以投入了很大的精力來研究聚丙烯酰胺化學降解特性。化學降解是 指聚合物溶液短期或長期與一些物質接觸，聚合物分子結構被該物質破壞的過程。根據降解 機理的不同，化學降解可分為氧化降解、光催化降解和高級氧化降解。
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1.3.2.1氧化降解
聚丙烯酰胺的氧化降解主要是自由基傳遞反應，其原理是利用強氧化劑或其他能量催化， 產生自由基並引發自由基連鎖反應使長鏈聚丙烯酰胺分子鏈斷裂形成小分子有機物，氧化反 應引起聚丙烯酰胺主鏈斷裂，使其分子量減少，最終被氧化降解成無機物。
氧化降解反應具有自由基連鎖反應的特征，在缺氧條件下，易發生分子鏈偶合，導致鏈 終結；氧氣充足時，易發生氧化降解反應。聚丙烯酰胺溶液中金屬離子的含量、種類也可影 響其降解情況，一般認為陰離子不起作用，低價金屬離子影響不大，唯有高價金屬離子的含 量和種類對聚丙烯酰胺降解影響較大。等離子濃度比條件下降解強度大小順序為Al3+>Mg2+ >Ca2+>Na+[77]。
多數研究均認為加入過氧化物/還原劑體係作為引發劑，隻有在適當配比下，才會使聚丙 烯酰胺降解程度最大化，這是由於如過氧化物過量會使還原劑被氧化，不利於降解反應的進 行。如果溶液中隻存在過氧化物，引入微量還原劑，會明顯促進降解反應進行。由於聚丙烯 酰胺的商業產品中可能有過氧化物殘留，顧此反應不需誘導期，直接生成自由基，通過進一 步自由基傳遞反應，使聚丙烯酰胺降解。
由於傳統氧化降解隻能將聚丙烯酰胺降解成小分子有機物，不能明顯降低水中COD，且 投資和運行成較高本高，易造成二次汙染，因此該方法未能被廣泛使用。
1.3.2.2光催化降解
光催化技術能徹底破壞聚丙烯酰胺結構，可在常溫、常壓下進行，不產生二次汙染，且 成本較低，是一種很有發展前途、對環境友好的處理技術[82]
現有研究表明，自然光和紫外線照射均可直接降解聚丙烯酰胺。Smith[83]用不同天然水 配製聚丙烯酰胺溶液，置於封口的玻璃瓶中，經日光照射6周，觀察溶液中丙烯酰胺、NH/ 和pH的變化，溶液中丙烯酰胺單體濃度顯著增長，NH/濃度下降，未見微生物濃度有明顯 改變。可判斷降解的主要原因是光照，不是生物降解。光降解聚丙烯酰胺的原理可用鍵能來 解釋：聚丙烯酰胺中C-N、C-H和C-C鍵的鍵能分別為414kJ.mol-1、420 kJ.mol-1和 340kJ.mol-1，要斷裂這些鍵所需的光照波長分別為288 nm、250 nm和325 nm。但是由於臭 氧層的存在，波長為286 nm〜300 nm的輻射完全被臭氧吸收，因此日光輻射隻能使C-C鍵 斷裂，對C-N和C-H鍵影響較小。李凡修[84-85]進行了超聲光催化降解含聚丙烯酰胺廢水技術 的研究。結果表明，該方法可基本上去除水中聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺的去除率可達97.5 %。 光化學法處理難降解有機物具有高效徹底的優點，但其處理成本相對較高，限製其發展空間。
1.3.2.3高級氧化降解
高級氧化技術[90]又稱深度氧化技術，其基礎時運用氧化劑和催化劑的作用，生成活性極 強的自由基，自由基與有機化合物作用，使水體中的大分子難降解有機物降解成低毒或無毒 的小分子物質。邵強等[86]采用Fenton試劑氧化法對含聚丙烯酰胺汙水進行了處理，降解率 能達到近70 °%„Ting Liu等[87]在pH值為6.8條件下，使用固定反應床對濃度為100mg.L-1聚 丙烯酰胺進行催化降解實驗，結果表明，聚丙烯酰胺降解率最高可達70 %，降解後溶液中
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幾乎不含鐵離子。
1.3.3微生物法
生物方法降解聚丙烯酰胺主要是利用微生物特定酶作用，以聚丙烯酰胺為營養源，在菌 株生長和代謝過程中將聚丙烯酰胺降解為小分子有機物和無機物的過程。
由於微生物降解技術較為成熟，且無二次汙染和運行成本較低，使微生物降解技術與處 理工藝在各種難降解汙染物的無害化處理領域發揮著核心作用。已有研究結果表明，生物降 解聚丙烯酰胺是聚丙烯酰胺的降解過程中的重要方法。由於微生物極強的環境適應性、高繁 殖速率和變異性，使微生物降解與無害化成為解決聚丙烯酰胺引起的環境汙染和潛在毒性的 有效手段[1〇]。
1.4微生物降解聚丙烯酰胺 1.4.1微生物降解聚丙烯酰胺機理
微生物降解聚丙烯酰胺的機理主要可分三類。如表1-1所示
表1-1微生物降解聚丙烯酰胺的機理 Tab. 1-1 The mechanism of microbial degradation of polyacrylamide
作用類型 機理
生物物理作用 生物化學作用 酶直接作用
生物細胞生長繁殖使聚合物水解、電離或質子化，發生機械性破壞，分 解成小分子聚合物
微生物對聚合物的分解，產生新物質。
微生物侵蝕使聚合物鏈斷裂或氧化，酶降解機理並非單一，而是複雜的 生物物理、生物化學協同作用，同時伴有相互促進的物理、化學過程。
生物降解是一種複雜的生物物化作用過程。菌種一般有兩種來源：一種是從環境中直接 獲取；另一種是通過細胞馴化培養篩選出對聚丙烯酰胺具有良好降解能力的菌種。作用過程 為[88,89]:微生物剛處於含聚丙烯酰胺環境時需經過一個適應過程，然後，微生物為獲得生存 所需碳或氮源，在基因控製下產生可降解聚丙烯酰胺的生物酶。微生物釋放的脫氨酶可斷開 分子的C一N鍵，解離出NH2-，一CO+與羥基結合形成羧基。另外，在有氧存在下的條件下， 微生物釋放的酶能夠使聚丙烯酰胺主鏈末端的一CH3逐漸斷開，並被其他酶分解。在多種微 生物酶、氧及胞外物質的參與下，聚丙烯酰胺大分子鏈被逐步降解，最終被降解成CH4、CO2 和H2O等，而降解出來的中間產物NH2-小分子有機物則被微生物作為氮源和碳源利用。
在微生物酶和胞外物質聯合作用下，聚丙烯酰胺的分子結構被破壞，長鏈大分子裂解成 短鏈小分子，再進一步分解成微生物所需的營養源，最終使聚丙烯酰胺溶液黏度下降；另外，
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在微生物的作用下，聚丙烯酰胺分子側鏈上的酰胺基被氧化成羧基，使降解後的聚丙烯酰胺 溶液體係酸度增加[89’90]。
1.4.2研究進展
過去一般認為聚丙烯酰胺對微生物具有毒性，有關降解聚丙烯酰胺生物生物降解的研究 國內外都很少出現在公開文獻報道中。早期Magdalmmk等[91]一些研究者曾提出聚丙烯酰胺 不可生物降解。但近年來的研究表明，微生物可利用或合成酶類、非蛋白質類和胞外其他物 質等物質，來分解聚丙烯酰胺，為微生物生長和繁殖提供原料及能量。
但後來有人提出，在以聚丙烯酰胺作為土壤中生活的微生物基質的試驗表明，微生物隻 能利用聚丙烯酰胺作為唯一的氮源，不能作為唯一碳源被。
H. M. Abdelmagid等[92]首次提出聚丙烯酰胺可被生物降解，研究表明，將聚丙烯酰胺投 入含有某些細菌的土壤中，無機氮的濃度增加，研究認為細菌釋放的酰胺酶可使聚丙烯酰胺 發生降解，同時產生大量無機氮。
據報道，微生物降解驅油用聚丙烯酰胺作用的微生物主要有硫酸鹽還原菌、產堿假單胞 菌、腐生菌、梭狀芽孢杆菌等[93]。
在國內，最早於1999年黃峰等研究了硫酸鹽還原菌對聚丙烯酰胺的降解[94]。由於油田 中聚合物驅的大範圍使用及含聚汙水的逐年增加，使國內研究者對含聚丙烯酰胺汙水的處理 研究逐漸增多。
黃峰等[95]以中原油田現場取樣的腐生菌（TGB)聚丙烯酰胺溶液中培養24h。實驗表明， 培養7天後腐生菌（TGB)是聚丙烯酰胺溶液粘度損失率小於12 %，說明腐生菌（TGB)對 聚丙烯酰胺的生物降解較緩慢。研究表明，菌體接菌量的大小、溶液的pH值及菌種活化次 數都會對聚丙烯酰胺的降解產生影響。硫酸鹽還原菌（SRB) [96]菌量達到3.6X104 mL-1時， 與30 °C培養7 d，使1 000 mg.L-1聚丙烯酰胺溶液粘度損失率達19.6 %，但隨後聚丙烯酰胺 粘度損失率不會隨培養時間的增加而增加。
孫曉君[97’ 98]等以葡萄糖好氧顆粒汙泥菌源模擬含聚丙烯酰胺廢水降解特性，研究表明， 汙泥中含有豐富的微生物並且有良好的微生物協同作用，對聚丙烯酰胺降解效果較好。培養 6 d，模擬含聚丙烯酰胺廢水降解，聚丙烯酰胺降解率可達40 %以上。經馴化後顆粒汙泥形 態變化顯著，粒徑大約減小50 %，同時汙泥顏色改變說明顆粒汙泥中優勢菌落發生了演替。
張英筠等[99]從被聚丙烯酰胺汙染的土壤和水樣中篩選出生長良好菌種3株，複配製成 菌懸液，然後將降解菌按10 %比例接入10 000 mg.L-1和5 000 mg.L-1的聚丙烯酰胺溶液中。 結果表明，該降解菌在高濃度聚丙烯酰胺溶液中最適合生長濃度為1 000〜10 000 mg.L-1，並 對10 000 mg.L-1聚丙烯酰胺溶液有良好的降解效果。
李宜強等[100]將油田含聚丙烯酰胺出水中篩選，得到由3株兼性菌組成的能以聚丙烯酰 胺作為碳源和氮源生長的混合菌，屬於假單胞菌和梭狀芽孢杆菌屬。研究表明，混合菌可在 45 C下降解聚丙烯酰胺，且聚丙烯酰胺溶液粘度明顯降低。
夏彥淵等[101]從油田驅油汙水中分離出7株有明顯降解效果的細菌，確定適合微生物降解
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聚丙烯酰胺的最優條件，為以石油為基礎培養基碳源，以NH4H2PO4為氮源，培養8 d溶液 粘度降到最低值，此後粘度基本不變，粘度降解率可達32.6 %。
趙敏等[102]利用Hungate厭氧技術，從含聚丙烯酰胺驅汙水中分離出篩選出一株聚丙烯 酰胺降解菌，經鑒定為腸杆菌屬。可以聚丙烯酰胺作為唯一碳源生長，將接菌後濃度為1000 mg-L-1的聚丙烯酰胺培養基，培養10 d，其降解率為24 %，且粘度下降40 %。
包木太等[103]篩選出一株降解菌，經過馴化後，篩選得到的降解菌株明顯適應了聚丙烯酰 胺環境，並可以在一定程度上降解聚丙烯酰胺。實驗結果表明：在聚丙烯酰胺溶液濃度為500 mg.L-1、pH值為7.5、溫度為35 °C的條件下，降解率最高可達到38.4 %。降解後，產生小 分子碎片，並對環境無害的物質。
高玉格等[104]從南陽采油廠含聚丙烯酰胺的汙水和配聚罐底泥中篩選出1組（共17株） 能在高礦化度下生長的混合菌群（由芽孢杆菌、黃杆菌屬、節細菌屬等組成），該混合菌群聯 合作用可降解部分水解聚丙烯酰胺和石油中的大分子烴類，從而獲得微生物新陳代謝所需的 碳源。在一定條件下培養一定時間，聚丙烯酰胺降解率及COD去除率均可達50 %以上。
郝春雷[105]等從大慶油田篩選4株聚丙烯酰胺降解菌種，複配組成複合菌並配置菌懸液進 行試驗。結果表明，在37〜45 C，pH 6.4〜8.0時，複合菌對聚丙烯酰胺有較強的降解能力。
包木太等[106]從勝利油田活性汙泥中分離篩選出1株降解效果較好的菌AS-2。試驗結果 表明，當培養時間為5 d、pH為8、溫度為40 C、原油為碳源、NaN〇3為氮源、濃度分別 為2.5、1.4 g-L-1時，聚丙烯酰胺降解率達到45.23 %。
陳慶國等[107]篩選出三株可降解聚丙烯酰胺得好氧菌種，命名為PM-2、PM-3、PM-4。 連續活化4次，將三株菌混合正交培養，優化出PM-2與PM-3混合菌降解效果最好。降解 條件為降解時間為3d，接種量為體積比3 %，適宜溫度為溫度為35〜45 C，適宜pH值為 6.0〜6.5，搖床振蕩速度為140r-min-1，礦化度2 500〜10 000 mg-L-1。濃度為300mg-L-1的聚 丙烯酰胺溶液降解率可達到42 %。
常帆等將[108]篩選出枯草芽孢杆菌FA16和假單胞菌CJ419。將FA16接種到廢水樣品中， 對數期持續6 d，11 d達到穩定期，聚丙烯酰胺降解率最大可達25 %。CJ419於30C條件下 培養，6 d達到穩定期，對聚丙烯酰胺的降解率最大可達30.4 %。2株菌聯合降解，5 d降解 率達到 35.6 %。
在國外，Suzuki等[109]對聚丙烯酰胺降解的研究大都集中在能否被降解及是被微生物作 為碳源還是作為氮源利用這幾個方麵。多數研究者認為聚丙烯酰胺不能被微生物完全降解， 隻能部分降解，即使被氧化或光降解形成的小分子量聚丙烯酰胺也具有很強的生物抗性。
M. M. Grula等[110]研究了土壤聚丙烯酰胺降解細菌與特定聚丙烯酰胺的相互作用，發現 該菌可根據土壤中植物的不同生長情況釋放出具有短暫活性的酰胺酶，促使CiN鍵斷裂， 提供氮源。
Kay-Shoemake等人[111]從土壤中篩選出微生物隻能作唯一氮源被微，但是不能作為唯一 碳源，原因可能是聚丙烯酰胺先被轉化為長鏈聚丙烯酸酯，聚丙烯酸酯可被微生物作為氮源 利用。
S.Magdaliniuk等[112]曾研究微生物對蒙脫石/聚丙烯酰胺懸浮液的影響，發現懸浮液濃度
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和黏度沒有變化，因此他認為聚丙烯酰胺不可被生物降解。但近年來，很多研究者篩選培養 出多種在特定條件下可降解聚丙烯酰胺的微生物，至今，大多數學者已經接受聚丙烯酰胺可 被生物降解的觀點。
為研究特定的細菌對聚丙烯酰胺降解作用，N. Kumchika等[113]從活性汙泥中分離篩選出 多株能降解水溶性聚丙烯酰胺的菌株。在無外加碳氮源的情況下，該菌株仍能生長繁殖，且 聚丙烯酰胺溶液的黏度降低，相對分子質量降至原來的1/4,培養基pH也從6.8降至5.8。 用核磁共振分析結果顯示，聚丙烯酰胺側鏈的斷裂數量較多，主鏈也存在一定程度斷裂，所 以他認為該菌株能以降解聚丙烯酰胺來獲取生長繁殖所需的碳氮源。
G. R. J. Sutherland等[114]研究發現，當培養條件不同時，白腐真菌對聚丙烯酰胺的降解 情況也不同。當外界氮源充足時，聚丙烯酰胺濃度沒有顯著變化，而不再外加氮源後，聚丙 烯酰胺降解速度提高了 1倍左右，結果表明缺少氮源時白腐真菌可降解聚丙烯酰胺並從中獲 取氮源。
Jeanine L.Kay-Shoemake等[115，116]從土壤中篩選出微生物，以聚丙烯酰胺作為生長基質， 實驗中發現：聚丙烯酰胺能作為唯一氮源，但不能作為唯一碳源被微生物降解，溫度為30°C 條件下培養7 d後，1 000 mg.L-1的聚丙烯酰胺溶液黏度降低19.6 %。
現有關於聚丙烯酰胺生物降解的研究中，一般認為在好氧條件下，微生物可利用聚丙烯 酰胺中的酰胺基作為氮源，形成丙烯酸殘體並放出氨氣；但是關於聚丙烯酰胺作為微生物唯 一碳源的報道卻很少，並且存在著一定的爭議，作為碳源利用非常困難除了由於其大分子難 於被微生物攝入到細胞體內並且進行降解外，即使在小分子量的情況下，其抗生物降解能力 仍然很強。
Schumann and Kunst[117]用14C標記陰離子和888电子游戏官网在活性汙泥中降解作用， 研究表明兩種聚丙烯酰胺都沒有被顯著降解（小於2 %)，在厭氧環境中也得到類似的結論。
C. A.Seybold等[123]指出聚丙烯酰胺降解過程受多種因素影響，微生物可將其作為唯一碳 源，但不能將其降解成單體。
張英筠[119]研究表明，聚丙烯酰胺溶液中菌體含量隨濃度升高而減少，當濃度小於12000 mg.L-1時生長很旺盛，當濃度大於20 000 mg.L-1時，菌種幾乎不能生長，由微生物生長動力 學可知，底物濃度過高或過低，都會抑製微生物生長，因此當聚丙烯酰胺濃度範圍在1 000〜 10 000 mg.L-1內，菌種可以將聚丙烯酰胺作為碳源而生長。
魏利[120]利用厭氧技術，從大慶油田石油采出液中分離篩選出一株聚丙烯酰胺降解菌A9。 該菌株可將聚丙烯酰胺分子鏈上的酰胺鍵水解成羧基，將大分子聚丙烯酰胺降解為小分子質 量的化合物，通過掃描電鏡和紅外光譜分析結果表明：菌株可以聚丙烯酰胺為唯一碳源。降 解後聚丙烯酰胺表麵結構發生變化，部分官能團改變。聚丙烯酰胺初始濃度為500 mg.L-1， 培養20 d時，生物降解率為61.2 %，並且溶液粘度顯著下降。
1.4.3複合菌優勢
隨著生產過程中各種化學添加劑的廣泛使用，大量有毒有害難於降解的物質進入環境中，
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使微生物生長環境變得越來越複雜的同時，對菌株生長繁殖也產生了極大危害。
在研究微生物對某種大分子有機物聚合物降解過程時，一般實驗室研究中首先會對單一 菌株降解聚合物的過程進行監控，這是由於單一菌株降解條件易於控製，結果清晰且重複性 好。但單以菌株降解效果一直不理想。隨著化學添加劑的廣泛應用，大量有毒有害物質進入 環境，而這些物質往往會對微生物降解表現出較強的抵抗作用，其主要原因是單一微生物不 具備單獨降解這些化合物的能力需要多種微生物或多個群落協同作用。因此在降解聚丙 烯酰胺的研究中，我們可以利用微生物種群間的協同作用來增強降解效果[122]。
常帆等[123]研究了假單胞菌和枯草芽孢杆菌聯合使用時對油田采出水中聚丙烯酰胺的降 解作用，認為微生物產生降解酶和胞外物質發揮作用使聚丙烯酰胺發生被降解。結果顯示， 兩種菌聯合培養25 d後溶液降黏率可達80.3 %，遠遠高於單獨使用枯草芽孢杆菌（25 %) 和假單胞菌（30.4%)，表明兩株菌的協同作用可提高汙水樣品中聚丙烯酰胺降解率。
董春娟等[121]研究認為微生物群落可以通過協同作用、共代謝和轉移中間產物來達生物降 解作用。在協同作用中，單菌種無法合成完整的酶係統來降解那些難降解物質，而微生物群 落中不同的基因擁有者可產生不同的酶，從而降解難降解物質。對於難降解物質，有些能被 單純厭氧微生物降解；有些則需經厭氧水解提高汙染物生物可降解性後，才能被好氧微生物 最終降解；而有些則需在同一體係中經曆一係列好氧、厭氧過程才能被降解。
佘躍惠等[124]將7株聚丙烯酰胺降解菌混合在一起，研究由混合菌對聚丙烯酰胺的降解情 況和對含聚丙烯酰胺廢水的處理情況，結果表明，混合菌可提高降解效果，微生物可不以聚 丙烯酰胺為碳源，但可引起聚丙烯酰胺降解，可能是由於微生物的群落效應，當存在合適底 物時，群落中一些微生物以這些底物為營養源生長繁殖，其代謝產物或產生的某些酶會與聚 丙烯酰胺發生相互作用，導致聚丙烯酰胺水解或斷鏈，而這些產物又被其他微生物利用，使 聚丙烯酰胺降解。
微生物降解作為對環境有好、且處理徹底，可進行原位異位修複，處理工藝已經應用在 多種領域發。由於微生物數量巨大、種類繁多、代謝活動旺盛和代謝類型多樣等特點，使在 物質轉化中發揮了重要作用。目前，分子生物技術和基因工程速發展，為微生物發展提供了 有效的技術支持，是的微生物技術必將成為解決聚丙烯酰胺在環境中危害的重要手段。
1.5研究內容
(1)聚丙烯酰胺降解細菌的篩選
采用平板脅迫的方法，從大慶市生產聚丙烯酰胺化工廠廠區土壤和排水溝泥水中篩選出 以聚丙烯酰胺為唯一氮源生長的細菌，根據各個被篩選出的細菌對聚丙烯酰胺的降解能力， 確定聚優勢降解細菌。
(2)聚丙烯酰胺降解細菌的鑒定
參照《常見細菌係統鑒定手冊》[125]觀察菌落特征、生理生化特性及16S rRNA法對聚丙 烯酰胺優勢降解菌進行鑒定。
(3)優勢降解菌以聚丙烯酰胺為唯一碳源、唯一碳氮源生長情況
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將篩選出的優勢降解細菌接到以聚丙烯酰胺作唯一碳源、唯一碳氮源的固體基礎培養基 上培養，觀察優勢降解菌是否生長。確定並比較降解情況和菌體生長情況。
(4)優勢降解菌及複合菌的生長及降解特性
能夠影響微生物生長、繁殖的環境因素有很多，本研究按照單因素控製的方法，重點考 察了聚丙烯酰胺底物濃度、底物pH值、培養溫度3大因素對優勢降解菌及複合菌生長和聚 丙烯酰胺降解情況的影響，並確定最佳生長及降解條件。
(5)不同碳氮源度複合菌降解聚丙烯酰胺的影響
外加少量碳源和氮源可促進微生物的生長和代謝作用，或導致種間競爭，從而抑製微生 物的生長和代謝作用。本試研究加入少量有機或無機碳氮源，研究不同碳氮源對複合菌降解 聚丙烯酰胺的影響。
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2材料與方法 2.1試驗材料 2.1.1聚丙烯酰胺原藥
聚丙烯酰胺MW，相對分子量1 000萬，由國藥集團化學試劑有限公司生產，批號F20110937。
2.1.2供試土樣和水樣
篩選降解菌的土樣：取自大慶市生產聚丙烯酰胺的化工廠廠區土壤和排水溝泥水。
2.1.3試驗培養基
試驗用培養基見表2-1。
表2-1試驗用培養基
Tab. 2-1 Culture medium used in the experiment
培養基名稱用途培養基成分
蔗糖30 gFe2(S〇4)3 0.03 g
NaCl 0.5 gK2HP〇4*3H2〇1.6 g
基礎培養液 (基）篩選降解細菌KH2P〇4*3H2〇0.4 g MgS〇4*7H2〇 0.06 gCaCl2 0.01 g ZnS〇40.05 mg
CuS〇4 0.05 mg蒸餾水1 000 mL
(瓊脂15〜20 g)
牛肉膏培養基降解細菌富集 菌落形態觀察牛肉膏3 g 氯化鈉5 g (瓊脂15〜20 g)蛋白腖10g， 蒸餾水1 000 mL
蛋白腖10 gNaCl 5 g
葡萄糖10g蒸餾水1 000 mL
葡萄糖發酵 基礎培養液生理生化試驗pH調至7.4
1 000 mL培養液加入1.6 %溴甲酚紫或溴麝藍1 mL， 混勻後使培養基呈藍色。常規滅菌後使用前以無菌操 作定量加入滅菌的濃糖液(濃度為20%)。
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15 表2-1試驗用培養基
Tab. 2-1 Culture medium used in the experiment
培養基名稱 明膠柱體穿刺法 培養基
培養基成分
蛋白腖1〇g 明膠120 g
用途
生理生化試驗 牛肉膏5 g NaCl 5 g
蒸餾水 1 000 mL
硫化氫產生試驗生理生化試驗 蛋白腖 20 g
培養基瓊脂15 g
硫代硫酸鈉0.6 g
調節pH 7.2
檸檬酸鐵銨0.5 g NaCl 6 g 蒸餾水1 000 mL
蛋白腖 5 g葡萄糖5g
NaCl 5 g蒸餾水 1 000 mL
pH 值 7.0〜7.2
胰蛋白腖10 g蒸餾水 1 000 mL
pH值調至7.2〜7.6
蛋白腖5 g葡萄糖 5 g
K2HPO4 5 g蒸餾水 1 000 mL
可溶性澱粉2g牛肉膏3 g
蛋白腖 5 g蒸餾水 1 000 mL
pH值調至7.2〜7.4
蛋白腖5 g蒸餾水 1 000 mL
pH值調至7.2
牛肉膏 3g 蛋白腖 5 g
NaNO3 1 g蒸餾水 1 000 mL
pH值調至7.2〜7.4
甲基紅試驗 培養基生理生化試驗
吲哚試驗培養基生理生化試驗
V.P試驗培養液生理生化試驗
澱粉水解試驗培
養基生理生化試驗
產氨試驗培養液生理生化試驗
硝酸鹽還原試驗 培養液生理生化試驗
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2.1.4試驗儀器與藥品
主要藥品為1)蔗糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、飽和溴水、碘化鎘、水合硫酸鋁、 重鉻酸鉀、過硫酸鉀、硫酸鋁鉀、冰乙酸、硫酸銀和抗壞血酸等均為分析純；2)蛋白腖和牛 肉膏為生化試劑。
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表2-2試驗用儀器
Tab. 2-2 Instrument used in the experiment
名稱型號生產廠家
單人單麵淨化工作台SW-CJ-1FD蘇淨集團蘇州安泰空氣技術有限公司
生化培養箱HPS-280哈爾濱東聯電子技術開發有限公司
手提式壓力蒸汽滅菌器YMSII-280B寧波市鎮海金鑫醫療器械有限公司
空氣浴振蕩器HZQ-C哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司
可見光分光光度計Mc上海精密科技儀器有限公司
電熱鼓風幹燥箱DHG-9240A上海一恒科學儀器有限公司
萬分之一電子天平ESJ120-4沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司
離心機TDL-60B-B湖南星科科學儀器有限公司
2.2試驗方法
2.2.1菌株的分離和富集
實驗樣品采自大慶市生產聚丙烯酰胺的化工廠廠區土壤和排水溝泥水，置於4 °C恒溫保 存。將采集汙染土樣稱取3 g,投入100 mL無菌蒸餾水中，在30 °C下至於搖床中振蕩（轉 速120 rmin-1)轉培養3 h後，稀釋至10-1、10-2、10-3和10-4。將5個稀釋度的懸濁液分別滴 加1滴於以聚丙烯酰胺作為唯一氮源的基礎培養基（聚丙烯酰胺濃度為100 mg.L-1)中，每 個稀釋度作3個平行，培養5 d。
待平板長出菌落，選擇生長狀況良好且有明顯性狀差異的細菌菌落，於牛肉膏固體培養 基中劃線純化，並將分離純化後菌株接入牛肉膏斜麵培基中培養2d，長出菌落後，於4 C 保存。
2.2.2聚丙烯酰胺降解細菌的篩選
采用平板脅迫法馴化降解菌，基礎培養基滅菌後，在無菌條件下加入一定量聚丙烯酰胺， 逐級添加聚丙烯酰胺，使其濃度分別為100 mg.L-1、200 mg.L-1、300 mg.L-1、500 mg.L-1、 700 mg.L-1和1 000 mg.L-1。將分離出的菌株接種到加入基礎培養基的平板上，於30 C下培
17
養5 d,每個濃度3次平行試驗。挑選生長速度快長勢好的細菌，接入牛肉膏斜麵培培基中 培養2d，4°C保存備用。
將保存備用的各菌株接入已滅菌的牛肉膏液體培養基中，在30 °C下於搖床中振蕩（轉 速120 rmin-1)培養2d。每株菌3個平行，取牛肉膏液體培養基在無菌條件下4 000 rmin-1 離心20 min。取下層菌體溶於無菌蒸餾水中，製成菌懸液。測其600 nm波長下的OD值， 使OD600為1.000左右，作為接種液，於4 C下保存備用。
在無菌條件下，將滅菌後的基礎培養基中加入聚丙烯酰胺，使其濃度為500 mg.L-1。按 照2%的體積比加入菌懸液，同時作不加菌懸液的對照實驗，在30 C下於搖床中振蕩（轉 速120 rmin-1)培養10 d，其後取出試驗樣品稀釋，用澱粉-碘化鎘分光光度法測其吸光度， 以蒸餾水作空白試驗，計算降解率，依據降解率的大小，篩選出優勢降解細菌。
2.2.3菌株生長及降解性能的評價
2.2.3.1菌體生長量
以樣品的OD600值作為菌體生長量的指標。
2 2 3 2聚丙烯酰胺的降解率
采用澱粉-碘化鎘分光光度方法測定聚丙烯酰胺的含量。
生物降解率ni (%)的表達式為：
C - C
rt, = 0^ x 100(式 3-1)
C。
式中：C0 ——降解前的聚丙烯酰胺含量，mg.L-1;
C,——降解後的聚丙烯酰胺含量，mg.L-1。
2.2.4聚丙烯酰胺優勢降解細菌的鑒定
2.2.4.1菌落形態觀察
用以滅菌槍頭吸取各優勢降解菌菌懸液1 mL分別滴在牛肉膏培養基平板上，每1菌株3 次重複，置30 C培養箱中1〜3d，每天觀察菌落特征。
2.2.4.2菌體形態觀察
用掃描電鏡觀察細菌菌體形態，方法如下：
取樣：菌種在牛肉膏培養基平板上培養成3d，刮下菌體；
固定：用2.5 %戊二醛固定，置於4 C的冰箱中固定1.5 h;
衝洗：用0.1 mol.L-1、pH值6.8的磷酸緩衝溶液衝洗，10 min後離心10 min取下層菌體; 脫水：分別用濃度為50 %、70%、80 %和90 %的乙醇脫水依次各一次，每次10 min後 離心10 min取下層菌體，用100 °%乙醇脫水，10〜15 min後離心10 min取下層菌體；
18
置換：叔丁醇：100 %乙醇=1: 1，純叔丁醇各一次，每次15 min後離心10 min取下層
菌體；
用ES-2030 (HITACHI)型冷凍幹燥儀幹燥處理後的樣品，約4 h，其後將樣品貼在掃描
電鏡樣品台上，進行真空鍍金，最後在掃描電子顯微鏡下觀察菌體形態特征。
2.2.4.3生理生化實驗
本實驗參照《常見細菌係統鑒定手冊》[125]對以選出的菌株進行生理生化性質測定。鑒定 方法主要有革蘭氏染色法、V-P實驗、葡萄糖產酸試驗、葡萄糖產氣試驗、接觸酶試驗、甲 基紅試驗、明膠液化、細菌的運動性觀察、硫化氫反應等。
(1)革蘭氏染色試驗
挑取少量菌苔，塗布於載玻片上，風幹，在火焰上固定，滴加結晶紫染色1〜2 min，水 洗，滴加碘液衝去殘水，使碘液覆蓋約1 min，水洗。濾紙吸去載玻片上的殘水，在白色背 景下，95 %的乙醇脫色，至流出乙醇無紫色，水洗。用番紅液複染約2min，水洗。幹燥後， 用油鏡觀察。菌體被染成藍紫色為革蘭氏陽性菌，被染成紅色為革蘭氏陰性菌。
(2)葡萄糖產酸、產氣試驗
接種：在無菌條件下用接種環沾取少量菌種，分別接種於葡萄糖發酵液試管中。另取葡 萄糖發酵1支，不接種任何菌作為對照。
培養：放入30 °C恒溫培養箱中培養3d。
觀察結果：與對照管比較，若培養液變黃，則結果為陽性，表明該菌能分解葡萄糖產酸; 若接種液顏色不變，結果為陰性，表明該菌不利用葡萄糖；若培養液中的小管內有氣泡為陽 性反應，表明該菌分解糖能產酸並產氣；如小管內沒有氣泡為陰性反應。
(3)吲哚試驗
接種：在無菌條件下用接種環沾取少量菌種於蛋白腖液體培養基中，以不接種作對照。 培養：放入30 C恒溫箱中培養3d。
觀察結果：取出試管，沿試管壁加入對二甲基氨基苯甲醛試劑（對二甲基氨基苯甲醛5.0g， 戊醇75 mL，濃鹽酸25 mL) 5〜10滴於液麵上，在液層界麵發生玫瑰紅色者為陽性反應， 仍為黃色者為陰性。
(4)硫化氫產生試驗
接種：在無菌條件下將菌種穿刺接種於培養基中。
培養：放入30 C恒溫箱中培養5 d。
觀察結果：如穿刺線上或試管底部變黑者為陽性反應。
(5)明膠液化試驗
19
接種：在無菌條件下將菌種穿刺接種於培養基中，以不接種作為對照。
培養：放入20 °C恒溫培養箱中培養10 d。
觀察結果：在20 °C以下溫室中觀察細菌生長情況和是否液化。若菌已生長且明膠表麵 無凹陷為穩定凝塊，則為明膠水解陰性；如果明膠部分或全部變為可流動的液體，則表示明 膠水解陽性；如細菌生長，明膠未液化，但表麵出現凹陷小窩，表示輕度水解，按陽性記錄。
(6)氧化酶試驗
在幹淨的培養皿裏放一張濾紙，滴加1 %的二甲基對苯撐二胺水溶液，僅使濾紙濕潤即 可。
接種：用白金絲接種環（不可用鎳鉻絲）沾取18〜24 h菌齡的菌體，塗抹在濕濾紙上。 觀察結果：在10 s內菌體呈現紅色者為陽性，60s後出現紅色者按陰性處理。
(7)過氧化氫酶試驗
接種：用鉑絲接種環挑取已培養18〜24 h菌種塗沫於滴有3 %〜5 %過氧化氫的幹淨的 載玻片。
觀察結果：若有出現氣泡，則為過氧化氫酶陽性反應，無氣泡者則為陰性。
(8)硝酸鹽還原試驗
接種：在無菌條件下用接種環沾取少量菌種於硝酸鹽液體培養基中，以不接種作對照。 培養：30 C恒溫培養箱內培養3d。
取2支試管倒入少許培養後的培養液，在其中分別滴1滴A液（稱取磺胺酸0.5 g，溶於 150 mL 3 %醋酸溶液中，保存在棕色瓶中）和B液（a -萘胺0.5 g，溶於50 mL蒸餾水中， 煮沸，慢慢加入30 %醋酸溶液150 mL，保存在棕色瓶內），在對照管中同樣加入A液，B液
各1滴。
觀察結果：如培養液變為棕色、橙色、玫瑰紅色、粉紅色，表示有亞硝酸鹽存在，為陽 性。如無紅色出現，可加1、2滴二苯胺試劑（二苯胺0.5 g溶於100mL濃硫酸中，用20mL 蒸餾水稀釋），如呈藍色反應，表示培養基中有硝酸鹽，如無藍色出現，表示硝酸鹽和新形成 的亞硝酸鹽已還原成其他物質，仍表示硝酸鹽還原為陽性。
(9)甲基紅試驗（M. R試驗）
接種：在無菌條件下用接種環接種少量菌體，於葡萄糖蛋白腖培養液試管中。
培養：30 C恒溫箱中培養3d。
觀察結果：振搖試管3 min，然後加入3〜4滴甲基紅試劑，若出現紅色為甲基紅試驗 陽性反應，黃色為陰性反應。
(10)微生物對澱粉的水解
製平板：將已融化並冷卻至50 C左右含澱粉的牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基，到入無菌培
20
養皿中，靜置冷凝。
接種：在無菌條件下用接種環沾取少量菌株，點種於平板上。
培養：30 °C恒溫培養箱中培養3d。
觀察結果：形成明顯菌落後，在平板上滴加路戈氏碘液（碘1.0 g，碘化鉀2.0 g，蒸餾 水300 mL)，如澱粉水解，則在菌落周圍有不變色透明圈，表示澱粉水解為陽性。若仍為藍 黑色，則表示澱粉水解為陰性。
(11)產氨試驗
接種：在無菌條件下用接種環沾取少量菌株。
培養：30 C恒溫培養箱中培養3d。
觀察結果：取少許培養液，加入Nessler試劑（將20 g碘化鉀溶於50 mL水中，並在此 溶液中加碘化汞小粒至溶液飽和為止，此後再加460 mL水和134 g氫氧化鉀，將上清液貯於 暗色瓶中備用）數滴，出現黃褐色沉澱為陽性。
(12)乙酰甲基甲醇試驗（V.P試驗)
接種：在無菌條件下將菌株接於葡萄糖蛋白腖培養液試管中。
培養：放入30 C恒溫培養箱中培養3d。
觀察結果：將搖動試管5 min，取培養液和等體積40 %KOH相混。加少許6 %a-萘酚純 酒精溶液，繼續振蕩，放入30 C恒溫培養箱內保溫15〜30 min，若出現紅色，即為V.P試 驗陽性反應。
2.2.4.4優勢降解菌16S rRNA序列的測定及係統發育樹的分析
此過程由上海生工生物工程技術服務有限公司完成，采用16S rRNA序列測定法對細菌 菌株的DNA進行提取、擴增以及序列測定。將所得測序結果上傳至美國基因數據庫 (GenBank)，與基因數據庫比對，並對獲得的同源序列進行序列分析，選擇相似度較高的菌 株作為參比菌株。將DNA序列導入Mega 4.0軟件建係統發育樹。
2.2.5聚丙烯酰胺含量的測定
采用澱粉-碘化鎘分光光度法測定聚丙烯酰胺的濃度，在100 mL的燒杯中，加入準確稱 取0.1000 g的聚丙烯酰胺，溶於大約30 mL的蒸餾水，待全部溶解後，轉移至100 mL的 容量瓶中，多次用蒸餾水衝洗燒杯，將衝洗過的蒸餾水轉移至容量瓶中，將容量瓶內加水至 刻度，搖勻，充分溶解。
然後用蒸餾水將1 000 mg_L-1聚丙烯酰胺溶液分別稀釋成10、20、30、40、50、60、70、 80、90 和 100 mg-L-1 各 50 mL。
加入5.0 mL的醋酸氨緩衝溶液於50 mL容量瓶中，加入2.0 mL以配置好的聚合物溶液， 加入20 mL蒸餾水混勻，其後加入2.0 mL飽和溴水，靜置10 min溶液為黃色，加入5.0 mL
1 %甲酸鈉溶液，待溶液褪色後搖勻，靜置5 min，至顏色完全褪去，加入5.0 mL澱粉-碘化
21
鎘溶液，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置10 mm後，用分光光度計以580 nm波長處測定 溶液的吸光度，以不加聚丙烯酰胺做空白樣作參比。繪製聚丙烯酰胺濃度與吸光度之間的標 準曲線及方程[126]。
2.2.6優勢降解菌以聚丙烯酰胺為唯一碳源或碳氮源的生長情況
把分離所得的優勢降解菌分別接菌在含聚丙烯酰胺500 mg.L-1去除蔗糖加入NH4CI和去 除蔗糖不加NH4CI的基礎培養基平板上，30 °C培養7 d，觀察降解菌是否能夠以聚丙烯酰胺 為唯一碳源和唯一碳氮源進行生長。
向除去蔗糖加入NH4CI和向除去蔗糖不加NH4CI的基礎培養液中加入聚丙烯酰胺，使其 濃度為500 mg.L-1，按照2 %體積比菌懸液，搖床培養10 d，測定菌體生長量和聚丙烯酰胺 的濃度，計算其降解率。
2.2.7聚丙烯酰胺優勢降解菌生長和降解特性
2.2.7.1聚丙烯釀胺優勢降解菌的生長曲線和降解率曲線
向已滅菌的基礎培養液中加入聚丙烯酰胺，使聚丙烯酰胺濃度為500 mg.L-1，接入體積 比2 %的各菌懸液，於30 C、120 r.mm-1在搖床中培養，每個處理設3次重複，每天取樣測 定菌體的生長量和聚丙烯酰胺濃度，共培養10d，繪製聚丙烯酰胺降解率的曲線和降解菌的 生長曲線，並依降解曲線確定後續試驗適宜時間。
2.2.7.2底物濃度對優勢降解菌生長和降解特性的影響
向已滅菌的基礎培養液中加入聚丙烯酰胺，使聚丙烯酰胺濃度分別為50、100、200、300、 500、700、1 000和1 500 mg-L-1，接入體積比2 %的各菌懸液，於30 C、120 r-min-1在搖
床中培養，每個處理設3次重複，按上述確定的適宜時間培養，取樣測定菌體生長量和聚丙 烯酰胺的濃度，依據其大小確定菌株適宜聚丙烯酰胺的底物濃度範圍及最適底物濃度。
2.2.7.3培養溫度對優勢降解菌生長和降解特性的影響
向已滅菌的基礎培養液中加入聚丙烯酰胺，使其濃度為最適底物濃度，接入體積比2 % 的各菌懸液培養，設置培養溫度分別為15 C、25 C、30 C、35 C、40 C和45 C，於 120 rmm-1在搖床中按確定的適宜時間進行培養，每個處理設3次重複，取樣測定菌體生長 量和聚丙烯酰胺的濃度，依據其大小確定菌株適宜溫度範圍及最適溫度。
2.2.7.4初始pH值對優勢降解菌生長和降解特性的影響
向已滅菌的基礎培養液中加入聚丙烯酰胺，使其濃度為最適底物濃度，用已滅菌的1 mol.L-1氫氧化鈉或1 mol.L-1鹽酸調整基礎培養液的初始pH值，使培養液的pH值分別為3、 4、5、6、7、8、9、10、11和12，接入體積比2 %的各菌懸液培養，於上述確定的適宜溫度 和120 rmm-1在搖床中培養，按確定的適宜時間取樣，每個處理設3次重複，測定菌體生長
22
量和聚丙烯酰胺的濃度，依據其大小確定菌株適宜初始pH值範圍及最適初始pH值。
2.2.8複合菌的生長和降解特性
將優勢降解菌分別交叉劃線，證明無拮抗作用後，進行後續試驗。
2.2.8.1優勢降解菌組合的確定
向已滅菌的基礎培養液中加入500 mg.L-1聚丙烯酰胺。將各優勢降解菌進行1:1組合培 養，於30 °C、120 rmin-1在搖床中培養10 d，每個處理設3次重複，依據各組降解菌對聚丙 烯酰胺的降解率和生長量的大小，最終確定出降解效果好的組合方式，即複合菌。
2.2.8.2複合菌的生長曲線和降解率曲線
複合菌的生長曲線和降解率曲線的試驗具體操作同2.2.7.1。
2.2.8.3培養溫度對複合菌生長和降解特性的影響
向已滅菌的基礎培養液中加入聚丙烯酰胺，使其濃度為500 mg.L-1，加入複合菌在確定 的適宜時間振蕩培養，其他具體條件和實驗操作同2.2.7.3。
2.2.8.4底物濃度對複合菌生長和降解特性的影響
向已滅菌的基礎培養液中加入聚丙烯酰胺，加入複合菌於確定最適溫度下，確定的適宜 時間振蕩培養，其他條件和操作同2.2.7.2。
2.2.8.5初始pH值對複合菌生長和降解特性的影響
向已滅菌的基礎培養液中加入聚丙烯酰胺，使其濃度為最適底物濃度，使培養液的pH 值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13，加入複合菌於確定的最適宜溫度下， 確定的適宜時間振蕩培養，其他條件和操作同2.2.7.4。
2.2.86不同碳氮源度複合菌降解聚丙烯酰胺的影響
基礎培養液中分別加入NH4CI、石油、尿素、NH4NO3、牛肉膏、蛋白腖，使其濃度為 100 mg.L-1，滅菌後加入聚丙烯酰胺，使其濃度為最適底物濃度，調節pH達到最適值，接入 體積比2 °%的複合菌懸液，於上述確定的適宜溫度和120 r.min-1在搖床中培養，按確定的適 宜時間取樣，每個處理設3次重複，測定菌體生長量和聚丙烯酰胺的濃度，計算聚丙烯酰胺 的降解率，依據其大小判斷不同碳氮源對複合菌對聚丙烯酰胺降解是否有影響。
2.2.9試驗數據的處理
試驗數據BLAST和SPSS處理，整理采用word完成製圖。
23
3結果與分析
3.1聚丙烯酰胺降解細菌的分離與篩選
按照2.2.1中的方法，培養3d後，觀察到10-4稀釋度的平板中較合適分離菌落，挑取其 中有明顯性狀差異的菌落細菌於牛肉膏固體培養基中劃線純化，並將純化後的菌株接入牛肉 膏斜麵培基中培養養2d，長出菌落後，於4 °C保存。
按照2.2.2中的方法，最終分離純化得到12株長勢較好的聚丙烯酰胺耐性細菌，其中1#、 2#、3#、4#來自生產聚丙烯酰胺的工廠周圍土壤，5#、6#、7#、8#、9#、12#、13#、14#來自 排水溝泥水。
將耐性細菌製成懸液，按2.2.2的方法培養，測定聚丙烯酰胺的降解情況。試驗結果見 表 3-1。
表3-1 12株耐性細菌對聚丙烯酰胺的降解能力 Tab. 3-1 12 Halophilic bacteria on degradability of polyacrylamide
菌株1#2#3#4#5#6#7#8#9#12#13#14#
降解率
(%)8.324.233.217.414.99.632.128.018.325.14.0321.3
由表3-1可以看出，培養10 d後，各株降解菌降解率不相同，篩選出3#、7#和8# 3株 優勢降解菌，分別命名為PAMB3、PAMB7和PAMB8。
3.2聚丙烯酰胺優勢降解細菌的鑒定
3.2.1培養特征
按2.4.4.1中的方法培養聚丙烯酰胺優勢降解細菌，觀察平板上單菌落特征，見表3-2。
表3-2 PAMB3、PAMB7和PAMB8培養的菌落特征 Tab. 3-2 Cultural characteristics of PAMB3、 PAMB7 and PAMB8
菌株菌落形狀菌落顏色基質顏色
PAMB3邊緣整齊同心圓 略中心突起乳白色淺紅色
PAMB7邊緣整齊水滴狀近透明顏色不變
PAMB8邊緣整齊同心圓白色顏色不變
3.2.2形態特征
按照2.2.4.2的方法，將3株細菌製備掃描電鏡標本，掃描電鏡放大5 000倍數，觀察結 果如圖3-1、圖3-2和圖3-3所示。
圖3-1 PAMB3的掃描電鏡圖片（巧000)圖3-2 PAMB7的掃描電鏡圖片（x5 000)
Fig. 3-1 SEM image of PAMB3 (x5 000)Fig. 3-2 SEM image of PAMB7 ( x5 000)
圖3-3 PAMB8的掃描電鏡圖片（x5 000) Fig. 3-3 SEM image of PAMB8 ( x5 000)
由圖3-1、圖3-2和圖3-3可看出，3株菌均為杆菌，其中PAMB3和PAMB8為短杆菌， PAMB7為長杆菌；菌株PAMB3柱體長度為1.73~2.36 pm，直徑為0.38~0.52 pm;菌株PAMB7 柱體長度為2.61~2.90 pm，直徑為0.47~0.55 pm;菌株PAMB8柱體長度為1.23~1.59 ―，直 徑為 0.51~0.69 pm。
25
3.2.3優勢降解菌的生理生化特性
表3-3優勢降解菌的生理生化特性
Tab. 3-3 Physiological and biochemical characteristics of bacteria
生理生化試驗PAMB3PAMB7PAMB8
革蘭氏染色+++
葡萄糖產酸+++
葡萄糖產氣———
氧化酶++—
過氧化氫酶———
甲基紅+—+
澱粉水解+++
產氨——+
硝酸鹽還原+++
產吲哚++—
硫化氫反應+——
明膠液化+++
V-P試驗+++
注：+為陽性。-為陰性
3.2.4優勢降解菌的16S rRNA序列測定
按照2.2.4.3的方法提取菌株PAMB3、PAMB7和PAMB8的DNA，由上海生工生物工程 技術服務有限公司對其進行擴增及序列測定。3株細菌的16S rRNA測序長度分別為1 455 bp、 1 415 bp和1 422 bp，堿基組成見附錄A、附錄B和附錄C，其序列在GeneBank數據庫的登 陸號分別為：KF051998、KF051999和KF052000。利用BLAST對比、分析係統發育樹（圖 3-4、圖3-5和圖3-6)、結合高效降解細菌的菌落形態特征、菌體形態特征和生理生化特征， 初步鑒定PAMB3為芽孢杆菌屬枯草芽孢杆菌■roh/te)、PAMB7為芽孢杆菌屬地衣 芽抱杆菌（)和PAMB8為類芽抱杆菌屬解澱粉芽抱杆菌（ amyloliquefaciens)。
26
Bacillus subtlils partial (HE681728.1) Bacillus subtilis strain(JQ435698.1)
Bacillus megaterium strain (Q965768.1)
_| Bacillus safensis strain (JQ951230.1)
Bacillus pumilus strain(JQ965500.1)
Bacillus cereus strain(JQ951231.1)
Bacillus licheniformis strain (JQ8460)
0.2
Bacillus licheniformis strain BAB-2257 Bacillus licheniformis strain NBMS48 Bacillus thuringiensis strain (JQ9222) Bacillus aryabhattai strain (JQ965767.1) Bacillus megaterium strain (JQ951232.1) Bacillus amyloliquefaciens strain (JX(2) [Bacillus amyloliquefaciens strain (JX)
I PAMB7 (KF051999)
Bacillus licheniformis strain(GU21625)
圖3-4聚丙烯酰胺優勢降解菌PAMB3的係統發育樹 Fig. 3-4 Phylogenetic tree of PAMB3
0.1
Bacillus cereus strain (JQ951227.1) Bacillus thuringiensis strain Bacillus thuringiensis strain (JX0513)
Bacillus cereus strain(JQ951231.1)
Bacillus vallismortis strain (JQ80669) PAMB8 (KF052000)
Bacillus amyloliquefaciens strain
Bacillus lentus strain NCIMB8773
圖3-5聚丙烯酰胺優勢降解菌PAMB7的係統發育樹 Fig. 3-5 Phylogenetic tree of PAMB7
0.01
圖3-6聚丙烯稀酰胺優勢降解菌PAMB8的係統發育樹 Fig. 3-6 Phylogenetic tree of PAMB8
27
Bacillus macauensis ZFHKF-1 (AKKV0100)
3.3聚丙烯酰胺優勢降解菌的生長和降解特性
3.3.1優勢降解菌以聚丙烯酰胺為唯一碳源或碳氮源的生長情況
按2.2.6的方法，優勢降解細菌PAMB3、PAMB7和PAMB8在30 °C培養7d的恒溫培 養箱裏培養，觀察到PAMB3不生長，PAMB7和PAMB8生長，因此，PAMB3不能以聚丙
烯酰胺為唯一碳源和唯一碳氮源進行生長，而PAMB7和PAMB8能以聚丙烯酰胺為唯一碳 源和唯一碳氮源進行生長。
PAMB7、PAMB8以聚丙烯酰胺為唯一碳源和唯一碳氮源時，10 d降解率分別為17.2%、 16.1 %和19.15 %、16.3 %。結果表明，PAMB7和PAMB8以聚丙烯酰胺為唯一碳源和唯一碳
氮源的降解率明顯低於它們以聚丙烯酰胺為唯一氮源的降解率。故後續僅研究它們以聚丙烯 酰胺為唯一氮源的生長和降解特性。
3.3.2優勢降解菌的生長曲線和聚丙烯酰胺降解曲線
按照2.2.7.1中的方法培養優勢降解菌PAMB3、PAMB7和PAMB8，取樣測定菌體生長
量和聚丙烯酰胺的濃度。3株菌的生長量及聚丙烯酰胺降解率的變化情況見圖3-7、圖3-8和 圖 3-9。
13579
培養時間/d
0.4
0.3
0.2
0.1
0
圖3-7 PAMB3的生長與降解曲線 圖3-8 PAMB7的生長與降解曲線
Fig.3-7 Curves of PAMB3 growth and
Fig.3-8 Curves of PAMB7 growth and
polyacrylamide degradation polyacrylamide degradation
28
0.4
0.3
0.2
0.1
0
振蕩培養7 d，取樣分
-1
圖3-9 PAMB8的生長與降解曲線 Fig.3-9 Curves of PAMB8 growth and polyacrylamide degradation
由圖3-7、圖3-8和圖3-9可見，3株優勢降解細菌經過短暫遲滯期，此階段 的環境，自我調節適應新的生長環境，生長緩慢。隨後進入對數生長期，此時菌 速、代謝旺盛，對聚丙烯酰胺的降解率也隨之增大。其後菌體生長進入穩定期， 率和死亡率達到平衡，降解率達到穩定。
3株優勢降解細菌的培養過程中細菌生長量和聚丙烯酰胺降解率的變化規律 先逐漸升高而後趨於穩定，到第7d後3株菌的生長量和降解率基本不變，由此 試驗培養時間為7 d。
3.3.3底物濃度對優勢降解菌生長和降解特性的影響
按2.2.7.2中的不同聚丙烯酰胺初始濃度配製方法配製基礎培養液，然,
PAMB3、PAMB7 和 PAMB8 菌懸液，於 30 °C，120 :
囷株進入新 株生長量迅 細菌的生長
一致，均為
可選擇後續
後分別接入 r析，3株菌
2所示。
0.4
0.3
0.2^
0.1
0
LJ6)E/_ 澳盤
20o o o
的生長量、聚丙烯酰胺降解率和降解量的變化情況，如圖3-10、圖3-11和圖3-1
圖3-10聚丙烯酰胺底物濃度對PAMB3生長和降解的影響 Fig. 3-10 Effects of the initial concentration of polyacrylamide on PAMB3 grow
polyacrylamide degradation
29
0.4
0.3
0.2
0.1
0
180
150
120
90
60
30
0
圖3-11聚丙烯酰胺底物濃度對PAMB7生長和降解的影響 Fig.3-11 Effects of the initial concentration of polyacrylamide on PAMB7 growth and
polyacrylamide degradation
40
35
30
25
20
15
10
5
0
"eE/_ 邀盤
30o
o o o
8 5 2 0 1119
502005001000
底物濃度/mg.L-1
0.4
0 5 2 1
%/齋邀盤
降〇解率
0
02005001000
底物濃度/mg.L-1
圖3-12聚丙烯酰胺底物濃度對PAMB8生長和降解的影響 Fig.3-11 Effects of the initial concentration of polyacrylamide on PAMB8 growth and
polyacrylamide degradation
從圖3-10、圖3-11和圖3-12可以看出，3株優勢降解菌對不同濃度聚丙烯酰胺均有降解 效果，且3株菌生長量、聚丙烯酰胺的降解率和降解量均隨底物濃度增大而呈現先升高後降 低的趨勢，雖然3株菌適宜範圍不同，但總體趨勢相同。3株菌對聚丙烯酰胺的降解作用有 一定的適應範圍，當濃度高時，聚丙烯酰胺的水解度下降，且會對菌體本身造成毒害作用， 抑製菌株生長和降解作用；當濃度過小時，氮源不足導致菌株生長緩慢。
從圖3-10可看出，在50〜1 500 mg.L-1底物濃度範圍內，PAMB3的生長量、對聚丙烯酰 胺降解率和降解量各最高值相應的底物濃度不同，分別出現在700 mg.L-1、300 mg.L-1和500 mg.L-1處。結合菌株的生長量、聚丙烯酰胺降解率和降解量變化情況，選擇500 mg.L-1為較 佳底物濃度。按照聚丙烯酰胺降解率大於20 %計，PAMB3降解適宜底物濃度範圍為200〜 700 mg-L-1。
由圖3-11可看出，PAMB7在底物濃度50〜1 500 mg.L-1之間，PAMB7的生長量、聚丙
30
烯酰胺的降解率和降解量各最高值對應的底物濃度不完全相同，分別出現在500 mg.L-1、300 mg.L-1和500 mg.L-1處。結合菌株的生長量、對聚丙烯酰胺的降解率和降解量變化情況，選 擇聚丙烯酰胺濃度為500 mg.L-1為較佳底物濃度。按照聚丙烯酰胺降解率大於20 %計， PAMB7降解適宜底物濃度範圍為50〜700 mg-L-1。
由圖3-12可看出，PAMB8的生長量、聚丙烯酰胺的降解率和降解量各最高值對應的底 物濃度不完全相同，分別出現在500 mg.L-1、300 mg.L-1和700 mg.L-1處。結合菌株的生長量、 對聚丙烯酰胺的降解率和降解量變化情況，選擇聚丙烯酰胺濃度為500 mg_L-1為較佳底物濃 度。按照聚丙烯酰胺降解率大於20 %計，PAMB8降解適宜底物濃度範圍為100〜700 mg.L-1。
3.3.4培養溫度對優勢降解菌生長和降解特性的影響
0.4
0.3
0.2
0.1
0
按照2.2.7.3的方法，將菌懸液接入含底物濃度500 mg.L-1基礎培養液中，於不同溫度、 120 rmin-1振蕩培養7 d取樣，菌體生長量和聚丙烯酰胺降解率變化情況見圖3-13、圖3-14 和圖 3-15。
圖3-13培養溫度對PAMB3生長和降解的影響 Fig. 3-13 Effects of temperature on PAMB3 growth and polyacrylamide degradation
由圖3-13可看出，當環境溫度在15〜45 °C之間時，PAMB3對環境溫度較敏感，降解 菌的生長量、聚丙烯酰胺降解率的隨溫度變化呈快速增大後快速降低的趨勢。在低溫15 °C 和高溫45 C時，PAMB3仍有一定的生長量和降解率，表明PAMB3對溫度具有很好的耐受 性。當環境溫度30 C時，聚丙烯酰胺降解率達到最大值，當溫度35 C時，生長量達到最大 值。因此，PAMB3的適宜溫度為30 C。按照聚丙烯酰胺降解率大於20 %計，PAMB3降解 適宜環境溫度範圍為25〜40 C。
31
0.4 0.3 0.2 ： 0.1 0
圖3-14培養溫度對PAMB7生長和降解的影響 Fig. 3-14 Effects of temperature on PAMB7 growth and polyacrylamide di
egradation
聚丙烯酰胺的降 ，菌株生長量和 ，降解率達到最 C和40〜45 C 〜35 C PAMB7
%/齋邀盤
崾§
15202530354045
培養溫度/°C
從圖3-14可看出，PAMB7環境溫度在25〜35 C時，聚丙烯酰胺降解細菌的篩選及降解特性,菌體的生長量和 解率較高，變化不大。當環境溫度在20〜25 C之間時，隨著環境溫度升高 聚丙烯酰胺降解率迅速的上升，25 C時，菌體生長量達到最大值；30 C時 大值；35 C後菌體生長量和聚丙烯酰胺降解率迅速下降。環境溫度15〜20 時，菌體的生長量和聚丙烯酰胺的降解率低。因此可確定適宜溫度範圍為25〃 的最適溫度為 30 C。
圖3-15培養溫度對PAMB8生長和降解的影響 Fig. 3-15 Effects of temperature on PAMB8 growth and polyacrylamide deg]
由圖3-15可看出，PAMB8對環境溫度反應敏感，在溫度為15〜30 C 降解率迅速升高，生長量15〜20 C略有增加後迅速上升，35 C時降解率和 當環境溫度高於35 C時，菌株的生長量和降解率快速下降，環境溫度15 C 菌株降解率低。按照聚丙烯酰胺降解率大於20 %計，PAMB8菌株的適宜溫; C，最適宜溫度為35 °C。
adation
時，聚丙烯酰胺 長量達最大值 :或40〜45 C時 度範圍是25〜35
32
0.4
0.3
0.2
0.1
0
按照2.2.7.4的方法，配製初始pH值不同的基礎培養液，滅菌後加入聚丙烯酰胺使其濃 度為500 mg.L-1，再加入菌懸液，使PAMB3和PAMB7環境溫度為30 °C，PAMB8環境溫度 為35 °C，在120 rmin-1條件下振蕩培養，7 d取樣，測菌株的生長量和聚丙烯酰胺的降解率， 結果pH對3株優勢降解菌的生長量、聚丙烯酰胺降解率的影響大，其具體變化情況見圖3-16、 圖3-17和圖3-18。
圖3-16初始pH值對PAMB3生長和降解的影響 Fig. 3-16 Effects of pH on PAMB3 growth and polyacrylamide degradation
0.4
0.3
0.2
0.1
0
初始pH
由圖3-16可看出，降解菌PAMB3對pH敏感，在pH值小於4或大於12時菌株幾乎不 生長。當pH值在3〜8時，其生長量和降解率隨pH值升高而迅速升高；當pH值在8〜9時 緩慢升高，在pH值為9時PAMB3的生長量和聚丙烯酰胺降解率達最大值；當pH值在9〜 10時，生長量和降解率緩慢降低；pH超過10時其迅速降低。按照聚丙烯酰胺降解率大於20% 計，PAMB3菌株的適宜範圍為6〜11，最適pH值為9,說明該菌株適合在pH值中性偏堿性 條件下生長。PAMB3在最適條件下對聚丙烯酰胺降解率為45.0 %。
圖3-17初始pH值對PAMFB7生長和降解的影響 Fig. 3-17 Effects of pH on PAMB7 growth and polyacrylamide degradation
33
由圖3-17可以看出，菌株PAMF7的生長量與聚j 變化幅度較大。pH值在3〜8之間，其生長量和降解率 為8時菌體生長量和降解率均達到最大值；當pH值大 的升高而迅速減小。pH值小於4或大於12時菌株幾2 酰胺降解率大於20 °%計，PAMB7的適宜pH值為6〜 宜在中性偏堿性環境中生長。在最適條件下，PAMB7
[率隨pH變化基本一致。 由升高而迅速升高，pH值 ^長量和降解率均隨pH值 解率也較低。按照聚丙烯 值為8,表明該降解菌適 g降解率為39.9 %。
丙烯酰胺降解 S隨著pH值控 於8時，其生 P不生長，降 11，最適pH 對聚丙烯酰胺
5C
4C
30
20
0.4
0.3
0.2
0.1
C
3456789 1C
初始pH
)11 12
圖3-18初始pH值對PAMB8生 Fig. 3-18 Effects of pH on PAMB8 growth ant
由圖3-18可看出，PAMB8在pH值小於4或大於
6時，PAMB8的生長量和聚丙烯酰胺降解率隨pH值升 生長量和降解率迅速升高；在8〜9時，緩慢升高，pH pH值10後，其生長量和降解率快速降低。按照聚丙類 株的適宜pH為7〜10,最適pH值為9,即該菌株適宜堿 對聚丙烯酰胺降解率為36.2 %。
3.4複合菌的生長和降解特性
長和降解的影 1 polyacrylam
ide degradation
12時菌株幾: f高緩慢增長 I值為9時達 令酰胺降解率 時生環境中生-
乎不生長。當pH值在3〜 ;當pH值在6〜8時，其 到最大值。隨後降低，當 大於20°%計，PAMB8菌 長。在最適條件下，PAMB8
C
3.4.1複合細菌的降解組合優化
經拮抗實驗表明，3株優勢降解菌均無拮抗作用。按照2.2.8.1的方法，聚丙烯酰胺降解細菌的篩選及降解特性,配製基礎培養液， 滅菌後加入聚丙烯酰胺使其濃度為500 mg.L1，再加入3 °%不同體積菌懸液，與30 °C、120 r-min-1條件下震蕩培養，10 d取樣，測複合菌生長量和聚丙烯酰胺的降解率，變化情況見表 3-3。
34
表3-3複合菌組合方式及降解率
Tab. 3-3 Compound mode of degrading-polacrylamide bacteria and degradation rate
組合378降解率（％)
三株0.670.670.6758.4±1.75
1.51.5052.6±2.08
兩株1.501.538.7±1.94
01.51.530.4±1.21
由表3-3可知，等體積比的3株菌組合及PAMB3、PAMB7組合的降解率較高，均明顯 高於各單菌，表明3株菌間有明顯的協同作用，尤其是PAMB3與PAMB7。將這兩種組合方 式分別命名為PB378和PB37。
3.4.2複合菌的生長曲線和降解率曲線
0
oooooo
6 5 4 3 2 1
%/齋邀盤
1357
培養時間/d
0
0
oooooo
6 5 4 3 2 1
%/齋邀盤
13579
培養時間/d
0
圖3-20 PB37的生長與降解曲線 Fig.3-20 Curves of PB37 growth and polyacrylamide degradation
圖3-19 PB378的生長與降解曲線 Fig.3-20 Curves of PB378 growth and polyacrylamide degradation
按照2.2.8.2中的方法培養混合菌PB378和PB37，取樣測定菌體生長量和聚丙烯酰胺的 濃度，混合菌的生長量及聚丙烯酰胺降解率的變化情況見圖3-19和圖3-20。
由圖3-19和圖3-20可知，PB378和PB37的培養過程中，其生長量和聚丙烯酰胺降解率 的變化規律一致，均為先逐漸升高而後趨於穩定。在1〜3d為複合菌生長的延滯期，複合菌 迅速生長、聚丙烯酰胺降解率變化不大；在3〜8 d為複合菌生長的指數期，複合菌迅速生長、 聚丙烯酰胺降解率迅速增大；8 d後趨於穩定。因此，可確定後續試驗的培養時間為8 d。
35
圖3-22培養溫度對PB37生長 和降解的影響
Fig. 3-22 Effects of temperature on PB37 growth and polyacrylamide degradation
圖3-21培養溫度PB378生長
和降解的影響
Fig. 3-21 Effects of temperature on PB378 growth and polyacrylamide degradation
按照2.2.8.3的方法，將PB378和PB37菌懸液接入含底物濃度500 mg-L-1基礎培養液中， 於不同溫度、120 rmm-1振蕩培養8 d取樣分析，菌體生長量和聚丙烯酰胺降解率變化情況見 圖3-21和圖3-22。
從圖3-21和圖3-22可看出，在環境溫度20〜50 °C時，對2組複合菌的生長量、聚丙烯 酰胺降解率的影響均呈現先增大後降低的趨勢。2組複合菌均能在45 °C以下生長和降解聚丙 烯酰胺。當環境溫度30 C時，其生長量和對聚丙烯酰胺降解率均達到最大值。按照聚丙烯 酰胺降解率大於20 °%計，複合菌PB378和PB37的適宜環境溫度均為20〜40 C，最適溫度 為 30 C。
3.4.4底物濃度對複合菌生長和降解特性的影響
按照2.2.8.4中的方法，配置不同底物濃度的基礎培養液，培養PB378和PB37, 8 d取樣 測定菌體生長量和聚丙烯酰胺的濃度，混合菌的生長量及聚丙烯酰胺降解率的變化情況見圖 3-23 和圖 3-24。
從圖3-23和圖3-24可看出，PB378和PB37的生長量和降解率隨底物聚丙烯酰胺的濃度 變化一致，均呈先升高後降低趨勢。底物聚丙烯酰胺濃度在300〜700 mg.L-1之間時，PB378 對聚丙烯酰胺降解率較高，而其生長量較高值在底物濃度為300〜1 000 mg.L-1之間，說明 PB378對聚丙烯酰胺有較好的適應能力。PB378和PB37的生長量和對聚丙烯酰胺降解率最 高值相應的底物濃度相同，均出現在700 mg.L-1處。按照聚丙烯酰胺降解率大於20 %計，複 合菌PB378和PB37的適宜聚丙烯酰胺濃度為50〜1 000 mg.L-1，最適濃度為700 mg-L-1。
36
0
o o o o o
6 5 4 3 2
%/騰裳逖
0
0
o o o o o
6 5 4 3 2
%/騰裳逖
1200
_°0
0
圖3-24底物濃度對PB37生長和 降解的影響
Fig. 3-24 Effects of the initial concentration of polyacrylamide on Curves of PB37 growth and polyacrylamide degradation
50200500800
底物濃度/mg*L-1
502005008001200
底物濃度/mg*L-1
圖3-23底物濃度對PB378生長和
降解的影響
Fig. 3-23 Effects of the initial concentration of polyacrylamide on Curves of PB378 growth and polyacrylamide degradation
3.4.5初始pH值對複合菌生長和降解特性的影響
按照2.2.8.5的方法，配製不同初始pH值、底物濃度為700 mg.L-1的基礎培養液，分別 加PB378和PB37複合菌，在環境溫度為30 °C、120 r.min-1條件下振蕩培養，8 d取樣，狽J
o o o o o o o
7 6 5 4 3 2 1
%/騰裳逖
_}ao
T 0.4 0.3 0.2 0.1 0
pH
圖3-26初始pH值對PB37生長
和降解的影響
Fig. 3-26 Effects of pH on PB37 growth and polyacrylamide degradation
圖3-25初始pH值對PB378生長
和降解的影響
Fig. 3-25 Effects of pH on PB378 growth and polyacrylamide degradation
37
2組複合菌的生長量和聚丙烯酰胺的降解率，其變化情況見圖3-25和圖3-26。
從圖3-25和圖3-26可看出，pH對2組複合菌的生長量、聚丙烯酰胺降解率的影響的變 化趨勢基本一致，均呈現先增大後降低的趨勢。PB378和PB37對pH的適應性非常強，當 pH值在4〜12之間時，2組複合菌均能很好的生長，在pH值小於2或大於13時菌株幾乎不 生長。在pH為9時PB378生長量和聚丙烯酰胺降解率達到最大值，而PB37在pH為8時達 到最大值。按照聚丙烯酰胺降解率大於20 %計，聚丙烯酰胺降解細菌的篩選及降解特性,複合菌PB378適宜pH範圍為5〜12，最適 pH為9; PB37的適宜pH範圍為5〜11，最適pH為8。PB378和PB37在各自最適條件下對 聚丙烯酰胺降解率分別為58.2 %和57.8 %。
3.4.6不同碳氮源對複合菌降解的影響
按照2.2.8.6的方法，配製濃度為100mg-L-1的NH4CI、石油、尿素、NH4NO3、牛肉膏、 蛋白腖的基礎培養液，使底物濃度為700 mg.L-1，分別加PB378和PB37，以3.4.5的最佳條 件培養為空白試驗，在初始pH分別為9和8，溫度為30 °C，120rmin-1條件下振蕩培養，8
iri
rtn
i-t.
o o o 2 1
(％)賺遨激
PB378 □ PB37
*
d取樣，測2組複合菌的生長量和聚丙烯酰胺的降解率，結果見圖3-27。
空白氯化銨硝酸銨尿素石油牛肉膏蛋白腖
不同碳氮源
圖3-27不同碳氮源對複合菌降解的影響 Fig. 3-27 Effects of different nitrogen source on polyacrylamide degradation
從圖3-27可看出，加入少量NH4CI和NH4NO3時，PB378和PB37對聚丙烯酰胺降解率 均有增加，分別為60.9 °%、60.4 °%和58.8 °%、59.5°%；加入少量石油時，2組複合菌對聚丙
烯酰胺降解率無明顯變化，表示石油對複合菌的生長和代謝無明顯影響。但加入尿素、牛肉 膏和蛋白腖時，2組複合菌對聚丙烯酰胺降解率很低。
38
4討論
4.1聚丙烯酰胺降優勢降解細菌的分離、篩選和鑒定
雖然可降解特定物質的微生物在環境中數量較少，可通過訓化和富集獲得活性和降解性 較強的特定微生物。目前以獲知的降解聚丙烯酰胺的細菌主要有硫酸鹽還原菌、產堿假單胞 菌、腐生菌、梭狀芽孢杆菌等。
本試驗采用平板脅迫法從生產聚丙烯酰胺的工廠周圍土壤和排水溝泥水分離出降解聚丙 烯酰胺的細菌。經長期的平板馴化培養後，適應性強的菌種存活下來，並且適應能力逐漸增 強，最後分離、篩選出3株可高效降解聚丙烯酰胺優勢菌種。通過觀察菌落形態和菌體形態、 細菌的生理生化特性及16SrRNA基因序列分析對3株優勢降解菌進行鑒定，分別確定 PAMB3、PAMB7為芽孢杆菌屬枯草芽孢杆菌沛fcO、地衣芽孢杆菌 //cAe«(/^rOT/5〇，PAMB8為類芽抱杆菌屬解澱粉芽抱杆菌（Sac/WMS aOTj/o/^gMeyhc/ews)。其中 地衣芽孢杆菌和解澱粉芽孢杆菌未見可降解聚丙烯酰胺報道，枯草芽孢杆菌已有報道，如常 帆等[112]篩選出枯草芽孢杆菌FA16。
4.2聚丙烯酰胺優勢降解菌及其複合菌的生長和降解特性
影響微生物生長繁殖的因素有很多，主要包括營養物質、溫度和pH，當環境因素發生改 變時，微生物的生長狀況也會發生變化，當環境因素劇烈變化或改變幅度較大時，則可能會 導致微生物死亡[127]。本試驗采用單因子變化法，研究不同環境因素對優勢降解菌的影響以確 定降解菌的最佳降解條件。
微生物的降解能力不單體現在降解率上，還體現在降解量和適應底物濃度上。在實際應 用中還要考慮環境溫度、pH等因素。
本試驗篩選的3株單菌及複合菌特性如下：
對於底物濃度，3株單菌及複合菌在50〜1 500 mg.L-1濃度的聚丙烯酰胺培養液中，生長 量和降解率均呈現先升高再穩定後迅速下降的趨勢。各單菌適宜的底物濃度分別是：PAMB3 200〜700 mg-L-1，PAMB7 50〜700 mg-L-1，PAMB8 100〜700 mg-L-1。複合菌 PB378 和 PB37
對底物濃度的適宜範圍均為50〜1 000 mg.L-1，可以看出各單菌對底物濃度適應範圍不同，均 小於複合菌PB378、PB37的濃度，表明單菌複配後適應底物濃度能力增強。3株優勢降解菌 的最佳底物濃度均為500 mg.L-1，而複合菌PB378和PB37為700 mg.L-1，說明單菌複配後最 佳降解底物濃度增加200 mg.L-1，降解能力明顯增強。
對於環境溫度，是微生物生長繁殖的重要因素，一方麵溫度過高會使生物酶失活，會對 生物體產生巨大的損害，甚至死亡；另外，溫度過低則會抑製生物體活性，使生長繁殖停止。 本試驗目的在於找到適宜每個優勢降解菌最適宜的溫度範圍，以達到高效降解聚丙烯酰胺的 目的。結果顯示，3株單菌及複合菌最佳生長和降解的環境溫度均為30 °C，而適宜的環境溫
39
度範圍不盡相同。PAMB3的適宜溫度範圍是25〜40 °C，PAMB7和PAMB8是25〜35 °C， 而 PB378 和 PB37 是 20〜40 °C。可以看出，PAMB3+PAMB7+PAMB8 複配（PB378)和 PAMB3+PAMB7複配（PB37)適宜溫度範圍比單菌寬，從適應環境溫度看，3株單菌及複合 菌均有較好地適應性，與自然環境溫度接近，複合菌更實用些。
對於pH值，一般石油行業含聚丙烯酰胺的汙水為偏堿性，聚丙烯酰胺降解細菌的篩選及降解特性,因此降解菌的適宜pH範圍為 降解含聚丙烯酰胺汙水的重要條件之一。本試驗結果表明，PAMB3和PAMB7適宜pH範圍 為6〜11，PAMB8為7〜10，PB378為5〜12，PB37為5〜11，可以看出複合菌的適宜pH 更寬些。PAMB3、PAMB8和PB378最適pH值是9，PAMB7和PB37最適pH值為8，無論 是單菌還是複合菌最適宜pH值在8〜9,偏堿性，單菌和複合菌均適合處理石油行業含聚丙 烯酰胺的汙水，複合菌更具優勢。
對於降解率，在各自最佳條件下，單菌PAMB3、PAMB7、PAMB8對聚丙烯酰胺的降解 率分別為45.0 %、39.9%、36.2%;複合菌PB378、PB37的降解率分別為58.2 %、57.8%。 可以看出複合菌降解率明顯高於單菌，表明PAMB3、PAMB7間和PAMB3、PAMB7、PAMB8
間均具有明顯的協同作用。
Jeanine L. Kay-Shoemake等[119’ 120]篩選出的微生物能以聚丙烯酰胺作為唯一氮源被微生 物所利用，溫度為30 C條件下培養7 d後，1 000 mg七―1的聚丙烯酰胺溶液黏度降低19.6 %。 包木太等[110]篩選的降解菌在聚丙烯酰胺溶液濃度為500 mg.L-1、pH值為7.5、溫度為35 C 的條件下，降解率最高可達到38.4 %。常帆等[112]將篩選出枯草芽孢杆菌FA16和假單胞菌 CJ419,兩株菌聯合降解5 d的降解率為35.6 %。而本實驗的枯草芽孢杆菌PAMB3的降解500 mg *L-1聚丙烯酰胺的降解率為45.0 %，與地衣芽孢杆菌PAMB7聯合降解率達到58.2 %，可 見本實驗獲得的菌株降解能力是較高的。
郝春雷[109]等篩選4株聚丙烯酰胺降解菌種，複配試驗表明，在37〜45 C，pH6.4〜8.0 時，複合菌對聚丙烯酰胺有較強的降解能力，可將其溶液黏度降低約61 %。李宜強等[104]篩 選3株兼性菌組成，降解聚丙烯酰胺溫度為45 C，且聚丙烯酰胺溶液粘度明顯降低。可以 看出以上複合降解菌的培養溫度較高，在實際應用中消耗的能量相對較高。本實驗在環境溫 度為30 C時，聚丙烯酰胺降解率和菌株生長量達到最大值，更適宜應用在常溫下的原位修 複，且所用菌株均適宜在pH為8〜9環境下生長，由於實際聚驅采油廢水偏堿性(pH7-10[128])， 更適合應用在采油廢水中聚丙烯酰胺的降解。
4.3不同碳氮源度複合菌降解聚丙烯酰胺的影響
由於聚丙烯酰胺是大分子有機物，微生物要利用其中氮源必須先釋放特定酶，使其酰胺 鍵斷裂，而後微生物利用產生的氮源大量繁殖。加入特定氮源後，微生物會先利用它生長， 並產生酶使酰胺鍵斷裂，從而加快降解聚丙烯酰胺的速度。本試驗結果表明，加入少量氯化 銨、硝酸銨和石油對降解無影響，說明無機氮源對複合菌的生長和降解無明顯影響，並且兩 組複合菌可用於采油汙水中聚丙烯酰胺的處理。而加入尿素、牛肉膏和蛋白腖時2組複合菌 對聚丙烯酰胺降解率很低，說明添加有機氮源，對聚丙烯酰胺的降解具有競爭作用。
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由於聚丙烯酰胺多用於提高油田生產采收率，聚丙烯酰胺降解細菌的篩選及降解特性,含聚丙烯酰胺汙水多為偏堿性液體（pH值 在7.5〜8.5[128])，且含有一定的石油。由於本試驗獲得的複合菌具有適應底物濃度大、常溫 環境溫度、pH範圍寬的特性，尤其是最適合中性偏堿性環境中生長，加之汙水中石油對其降 解聚丙烯酰胺無影響，說明其非常適用於實際應用，尤其是應用於采油汙水處理。
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5結論
5 1優勢降解細菌的篩選及鑒定
采用平板脅迫方法從大慶生產聚丙烯酰胺化工廠廠區土樣和排水溝泥水篩選出3株以聚 丙烯酰胺為唯一氮源聚丙烯酰胺優勢降解菌PAMB3、PAMB7和PAMB8。
通過平板培養和掃描電鏡對菌落形態和菌體形態觀察及細菌的生理生化特性試驗、16S rRNA基因序列分析，對3株優勢降解菌進行鑒定，初步確定PAMB3、PAMB7分別為芽孢 杆菌屬的枯草芽抱杆菌（方ac/7/狀)、地衣芽抱杆菌（方ac/7/w6* //^夥價削)，確定PAMB8 為類芽孢杆菌屬的解澱粉芽孢杆菌（召此///狀)。
PAMB7和PAMB8均可以聚丙烯酰胺為唯一碳源、唯一氮源和唯一碳氮源生長，而 PAMB3僅能以聚丙烯酰胺為唯一氮源生長。
5 2聚丙烯酰胺降解菌的生長及降解特性
以聚丙烯酰胺為唯一氮源對3株優勢降解細菌的生長及降解聚丙烯酰胺的情況進行研 究，試驗結果表明：
PAMB3的適合初始聚丙烯酰胺濃度為200〜700 mg.L-1，最適底物濃度為500 mg.L-1;適 合pH值為6〜11，最適合的初始pH值9;適合溫度為25〜40 °C，最適溫度為30 °C。在最 佳條件下對聚丙烯酰胺降解率為45.0 %。
PAMB7的適合初始聚丙烯酰胺濃度為50〜700 mg.L-1，最適底物濃度為500 mg.L-1;適 合pH值範圍為6〜11，最適合的初始pH值8;適合溫度為25〜35 C，最適溫度為30 C。 在最佳條件下對聚丙烯酰胺降解率為39.9 %。
PAMB8的適合初始聚丙烯酰胺濃度為100〜700 mg.L-1，最適底物濃度為500 mg.L-1;適 合pH值範圍為7〜10，最適合的初始pH值9;適合溫度為25〜35 C，最適溫度為35 C。 最佳條件下對聚丙烯酰胺降解率為36.2 %。
5 3複合菌的生長及降解特性
以聚丙烯酰胺為唯一氮源，將3株降解菌進行組合降解實驗，結果顯示，聚丙烯酰胺降解細菌的篩選及降解特性,PB378(PAMB3、 PAMB7和PAMB8組合）和PB37 (PAMB3和PAMB7組合）對聚丙烯酰胺降解率較高。研 究2組複合菌的生長及降解情況，試驗結果表明：
PB378和PB37的適合初始聚丙烯酰胺濃度為500〜1 000 mg-L-1，最適濃度為700 mg-L-1; 適合溫度為20〜40 C，最適溫度為30 °C。PB378適合初始pH值範圍為5〜12,最適合pH 為9; PB37適合初始pH值範圍為5〜11，最適合pH為8;在各自最佳條件下，PB378和PB37 對聚丙烯酰胺的降解率分別為58.2 %和57.8 %。
與複合菌中單菌相比，PB378和PB37的降解聚丙烯酰胺的能力及對底物濃度、環境溫
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度及pH值的適應能力更強，更具實用性。
5 4不同碳氮源度複合菌降解聚丙烯酰胺的影響
試驗結果表明，在最佳條件下，加入少量NH4CI和NH4NO3時，PB378和PB37的降解 率分別為60.9 %、60.4 %和58.8 %、58.3%，與不加NH4CI和NH4NO3組無明顯差異，表明 NH4CI和NH4NO3對複合菌的生長和代謝無明顯影響；加入少量石油時，兩組複合菌的降解 率均無明顯變化，表示石油對複合菌的生長和代謝無明顯影響。但加入尿素和牛肉膏時兩組 複合菌的降解率很低。表明尿素和牛肉膏對PB378和PB37降解聚丙烯酰胺具有競爭代謝作用。
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