聚丙烯酰胺水凝膠對細胞的細胞毒性研究:
聚丙烯酰胺水凝膠對細胞的細胞毒性研究,聚丙烯酰胺屬水凝膠類，是新型的醫用高分子 材料。水凝膠是親水性高分子在水中溶脹後，加入 適量的交聯劑，得到的高含水的三維網狀結構的水 膨潤性凝膠(Hydrogel)。因為它們具有相當高的含 水量，在物理性質上柔軟、富有彈性、橡膠般粘稠性， 與人體組織很相似。是近年來醫用生物材料領域研 究的熱點。聚丙烯酰胺是丙烯酰胺交聯聚合製成的 水凝膠產品，因而對人體組織有良好的相容性和抗 凝血性能，己被製成人工血管、人工尿道等抗凝血材 料、各種吸放藥物的凝膠劑等而得到廣泛的應用。 1987年烏克蘭率先將聚丙烯酰胺水凝膠作為軟組 織填充劑應用於美容整形外科中，達到了良好的美 容效果。1997年該材料通過國家藥品監督管理局 正式引進我國，並投入臨床使用。1998年我國長春 富華公司也研製出同類產品。
但由於以往液體石蠟、矽凝膠等軟組織填充材 料在臨床應用中曾引起了嚴重的並發症[1~3,給人 們帶來了慘痛的教訓。因此對於聚丙烯酰胺是否能 作為軟組織填充材料用於人體，目前爭議仍很大。 本實驗用四唑鹽法比色法(M TT Assay )觀察聚丙烯 酰胺水凝膠對L929細胞的細胞毒性作用，以期為 臨床上安全使用提供科學依據。
1材料與方法 1.材料
1.1.1受試物進口聚丙烯酰胺(商品名英捷爾法 勒，簡稱IT,烏克蘭生產）國產聚丙烯酰胺(商品名 富華軟組織填充劑，簡稱FH,富華公司生產）
1.1.2細胞係鼠成纖維細胞L929細胞由本校 口腔生物學教研室提供。
1.1.3試劑RPM 1640培養液、胎牛血清(FBS)、 MTT,胰酶、二甲基亞碸(DMSO)、丙烯酰胺。
1.2方法步驟L929細胞複蘇傳代後，於對數生 長期，用0. 25 %胰酶消化後吹散，作細胞計數，用 1640調整細胞濃度至0. 2X 105個/ml。用微量移 液器以100W/孔置於96孔板中複種4 ?L，在5% CO2、37°C標準環境下以含10%FBS的1640孵育。
陽性對照用0.7%丙烯酰胺交換，實驗 組分別用2倍濃度的培養液和H2〇稀釋IT及FH 至50%、25%和12.5%,每孔2004交換，然後置入 培養箱中繼續培養。分別於第2天、4天及6天各 取出一塊培養板，每孔加入20W的MT T溶液，繼續 培養4 ~ 6小時，然後，棄去孔內液體吸出聚丙烯酰 胺水凝膠。每孔加入150ul DMSO。振蕩10分鍾， 用酶聯檢測儀在490nm波長檢測光吸收值（OD)， 取4孔平均值。按照下列公式計算相對増殖率 (Relative growth rate, RGR)4]。
RG R=實驗組吸光值x 100 %
RGR=寸照組吸光值100 %
然後根據RGR值按以下標準評分定出材料的
毒性級別： 評分相對增殖率（％)
0級>100
1級75 〜99
2級50 〜74
3級25 〜49
4級1〜24
5級0
2結果
2.1相差顯微鏡觀察3種不同濃度的兩個受試
物組在加藥後第2、4、6天的細胞形態與陰性對照組 細胞形態基本相同，聚丙烯酰胺水凝膠對細胞的細胞毒性研究,呈梭形或三角形，貼壁良好，生 長旺盛。陽性對照組細胞在加藥後第2天有近1/3 死亡，餘下的細胞貼壁生長不良，細胞圓縮。第4天 時90%的細胞死亡。
表1國產及進口聚丙烯酰胺水凝膠及對照組的吸光值(OD) x±s
材料2日吸光值4日吸光值6日吸光值
聚閃烯酰胺濃度x 士 sx 士 sx 士s
空白對照組0.58±0.011 60士0 071 97 士0 09
IT112. 50.56 士 0.081.46 士 0. 131 79 士0 09
IT2250.54 士 0. 121. 33 士 0.071 76 士0 07
IT3500 .52士0 .021. 36 士 0.031 79 士0 13
FH112. 50.57 士 0.071 35士0 061 80 士0 08
FH2250 55士0 181. 39 士 0. 141 76 士0 11
FH3500 52士0 201 40士0 081 90 士0 08
陽性對照0.22 士 0.030. 14 士 0.030 05 士0 04
聚丙烯酰胺各組之間及與陰性對照組比P> 0. 05,陽性對照與陰性對照組比0. 01
表2相對增殖率及毒性評分
材料2日吸光值4日吸光值6日吸光值
聚丙烯酰胺濃度（％)RGR評分RGR評分RGR評分
空白對照組100010001000
IT112 596 6191 2190 91
IT22593 1183 1189 31
IT35089 7185190 91
FH112 598 3184 4191 31
FH22594 8186 9189 31
FH35089 7187 5196 41
陽性對照0 737 938 7542 534
3討論
31關於MTT法目前，世界上己有多種細胞毒 性試驗方法被應用於醫學材料的毒性評定，如瓊脂 覆蓋法，同位素標記法(51心-、3隻、125^4隻)，分子濾過 法，細胞増殖度法，細胞形態觀察法及細胞圖像分析 儀定量法等5。1983年Mosmann[6]首次報道了 一' 種新的快速評定細胞増殖和細胞毒性的比色分析法
MTT試驗法。1987年Twentyman[?l等報道
用MTT檢測細胞活性，並認為可以代替活細胞計 數、同位素標記法進行細胞毒性試驗。MTT是一種 能接受氫原子的染料，化學名為3 —（4 5 —二甲基 噻唑一 2)—2.5—二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑 藍。其原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使 外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物，並 沉積在細胞中，而死亡細胞無此功能。DMSO能溶 解細胞中的紫色結晶物，用酶聯免疫檢測儀在 490nm波長處測定其吸收值，可間接反映活細胞數 量。由於結晶物形成的量與細胞數量及其活性成正 相關，聚丙烯酰胺水凝膠對細胞的細胞毒性研究,通過比色、測定光吸收值(OD)，可計算出各實 驗組細胞相對増殖率，即可反映出細胞的數量及其 活性。該方法靈敏度高、重複性好、操作簡便、經濟、 快速，無放射性汙染，與細胞計數和核素摻入等方法 有良好的相關性[8,故我們采用了此方法。MTT 實驗結果顯示:加入3個濃度的進口與國產聚丙烯 酰胺水凝膠的L929細胞在培養2日、4日、6日的 MTT結晶顯示：國產聚丙烯酰胺與進口聚丙烯酰胺 兩者及它們各自3種不同濃度的MTT結晶形態 上，數量上無明顯區別，與所測的OD值相符，但隨 著培養時間的延長，MTT結晶不斷増多，這一點也 是符合L929細胞的増殖規律的，也與我們所測的 OD值相一致。
3.2關於聚丙烯酰胺的毒性醫用聚合物材料一
般要同體液相接觸，聚合物本身通常是沒有毒性的， 聚丙烯酰胺水凝膠對細胞的細胞毒性研究,引起炎症和組織反應的主要原因是聚合物中的易溶 出物質。這些易溶出物質一般包括殘留的原料單 體、低分子聚合物、催化劑和其它添加劑等等。動物 試驗雖可反應出醫用聚合物溶出物的毒性情況，但 要定量地考察出聚合物溶出物對生物的影響則是比 較困難的。而體外細胞培養精確性、敏感性均較高， 有可能大量提供在同一時期、條件相同、性狀相似的 實驗樣本[8]，既可減少在哺乳動物身上進行的聚合 物材料模擬實驗的昂貴費用，又能避免因動物來源 不同而造成的影響。因而可用體外細胞培養來評價 聚合物中可能存在的低分子量的物質及聚合物中可 溶出物的細胞毒性影響。
本實驗采用標準的成纖維細胞株L929在三個 濃度組份的進口及國產聚丙烯酰胺培養液中用倒置 顯微鏡及MTT法觀察比較結果顯示，各個濃度的 IT和FH對L929細胞未發現對細胞生長有抑製作 用，對細胞形態亦無明顯影響。IT、FH相對増殖速 度較大，均屬RGR分級標準1級，幾乎沒有毒性，判 為合格，顯示了國產及進口聚丙烯酰胺作為軟組織 填充材料有較好的安全性。聚丙烯酰胺水凝膠對細胞的細胞毒性研究,且國產聚丙烯酰胺與進 口產品相比未見毒性上明顯差異，安全指標上達到 同類進口產品要求。實驗中所見細胞在加有聚丙烯 酰胺的培養液中貼壁生長良好，可能是由於聚丙烯 酰胺在性質上相當於細胞間質，支持了細胞的生長。 據報告1967年烏克蘭的微生物學家和細胞學家應 用聚丙烯酰胺水凝膠作為細胞培養基，同時證明該 種材料對細胞無毒性，微生物和細胞可在該種材料 內生長和分裂。這一結論還有待進一步實驗證實。
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