聚丙烯酰胺體係中原油的生物降解作用研究：
聚丙烯酰胺體係中原油的生物降解作用研究，油田采出水的處理是目前油田亟待解決的重要問題之一。聚合物驅采出水中 聚合物的存在對水處理產生一定影響。目前我國各大油田使用的聚合物主要為部 分水解聚丙烯酰胺（partially hydrolylamide polyacrylamide, HPAM)。
HPAM是一種線型高分子聚合物，結構單元中含有酰胺基，極易與其他化合 物形成氫鍵，PAM具有一係列性能如：水溶、增粘、流變、分散、絮凝、減阻、 表麵活性等。聚合物驅是一種改性水驅，采油汙水具有水量大、成分複雜和難以 處理的特點，其中高粘度、強乳化穩定性和可生化性更差是其區別於其它采油汙 水的主要特征。
油田生產過程中產生大量汙水，在進行回注或者外排之前水體中各種成分需 要控製在一定標準，汙水中含有的原油是處理的重要組分之一，而生化處理是汙 水處理過程中的一個重要步驟。HPAM的存在對含油汙水處理的產生較大影響， 主要表現為：采出汙水中含有聚合物，造成汙水粘度增加；采出汙水中油珠變小 了；采出汙水中懸浮物物質增多，去除更加困難。HPAM對汙水中原油的存在形 式產生影響，溶液性質、微生物生長環境也會發生改變。
本論文是在聚丙烯酰胺環境中對原油進行生物降解研究。論文內容分為五部 分。第一部分為文獻綜述；第二部分是HPAM乳液中原油的回收率；第三部分 是原油的生物降解；第四部分是HPAM存在條件下，細菌對原油的降解作用； 第五部分是存在問題和展望。
本論文主要研究內容為在HPAM存在條件下微生物對原油的降解作用。通 過實驗研究主要得出如下結論：
1.對本論文所用到的聚丙烯酰胺的分子量進行了測量，計算得到聚丙烯酰胺 的粘均相對分子質量M=9.184x106。澱粉碘化鎘法能夠更好的適用於測定複雜水 質中的HPAM濃度。HPAM水溶液相對粘度相對於其濃度呈指數增長，在單一 鹽效應作用下，仍保持指數增長模式。在HPAM與原油形成的的乳狀液中，當 通過調節pH、投加無機鹽、滅菌、機械剪切等手段使HPAM溶液粘度降低時，
原油回收率則相應提高。
2.篩選出3株對原油具有一定降解效果的細菌並定性考察了 3株細菌的生 理生化性質;通過構建優勢混合菌，並優化出細菌降解原油的環境條件為:pH =7, 最佳鹽度為NaCl=3g.L-1，溫度35°C;初步探索了添加PAM對細菌生長及對原 油降解效果的影響。添加HPAM對細菌生長具有一定促進能力，原油降解率略 有提高
4.在聚丙烯酰胺環境中，經發酵罐控製連續發酵7天，三株細菌對原油具 有良好的降解效果。細菌對原油組分中的大部分烷烴和芳烴都具有明顯降解效 果，對烷烴總體降解率為70%,對芳烴總體降解率為80%。因為聚丙烯酰胺的 存在，原油發酵時乳化明顯，發酵結束後體係中原油發生了絮凝沉降。
油藏儲存在地層中，在石油的開采過程中，采出的石油通常都具有一定的含 水率。在油田初級開發階段，當鑽穿油層完井後，原始地層壓力可推動部分油、 氣、水等匯聚井底，並沿鑽井升至地麵。像這樣，依靠地層天然能量克服重力及 其它阻力而被舉升原油的生產方式稱為自噴采油，也稱之為一次采油，此種采油 方法，采出原油中水分比例很低。當地層壓力降低後對油田進行注水開發和注氣 開發等方式。注水開發是國內外普遍采用的油田開發方式，通過注水對油層補充 能量，是保持油層壓力、延長自噴采油期、提高采油速率和采收率的一項重要措 施。當向地層注入水量達到一定程度後，注入水和原油一起被采至地麵，當油藏 儲量減少，注入水則不斷增多，伴隨開采的進行，采出液中含水率不斷上升。隨 著我國陸上石油生產的不斷進行，大部分油田自噴采油階段已經結束，而進入到 中後期開采階段，通過改變注入水的特性提高油田采油率已成為主要的開采方 式。目前，世界上采用“提高原油采收率（EOR)”這個術語來概括除天然能量 采油和注水、注氣采油以外的任何采油方法。通稱的EOR方法主要有：熱力驅 油法、混相驅油法和化學采油法等。以聚合物驅油為代表的三次采油技術在我國 陸上油田得到推廣應用。聚合物驅是一種化學驅油法，即通過在注入水中加入化 學試劑（高聚物）來改善水的驅油及波及性能，進而提高采油率的方法。
在自噴采油中，原油含水率很低。而通過注水或在注入水中添加化學試劑來 提高采收率，一些油田開采後期，采出液的綜合含水比例會超過90%。而對原油 進行脫水處理是在原油作為成品外輸前的必要步驟，經油水分離，油田生產過程 中產生大量含油汙水。
在對含油汙水的無害化處理過程中，降低原油含量是一個重要指標。隨著聚 合物驅在我國油田的應用，產生了大量的含油含聚汙水，聚合物的特性使油田采 出汙水性質發生較大變化，現有汙水處理工藝出現不適應，處理效果變差。在對 此類汙水的生化處理過程中，聚合物的存在對原油去除能力會產生影響，本論文 從含油汙水中篩選得到對原油具有降解和絮凝效果的三株細菌，以含油含聚汙水 作為研究對象，考察了含聚丙烯酰胺的油田汙水中細菌對原油的降解作用。
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1.文獻綜述
在我國的油田開發建設曆史上，從20世紀60、70年代著手研究油田含油汙 水處理工藝建立含油汙水處理係統，在油田環保方麵取得了較大的成績。但是到 目前為止油田環保工作仍明顯落後於油田生產發展，滯後於國家環保要求。油田 汙水的不達標回注和外排，會對環境造成汙染，影響油田地麵設施的正常運作， 而且還可能堵塞地層而帶來危害，影響油田安全生產。
注水開發對油田生產至關重要，但也帶來了諸多問題。其中兩個顯著的問題 就是注入水的來源以及汙水的排放問題。油田是用水大戶，清水通常來自於地表 水或開采地下水，為油田生產提供量大而穩定的水源是油田穩定生產的保障，而 水資源的過度消耗及地下水的過量開采會給生態環境造成壓力；隨著地下原油在 水驅作用下不斷被開采到地麵，采出液中，原油比例會逐漸降低，而含水量卻在 不斷的上升，為了保證原油較低的含水率，越來越多的水分需要經脫水站處理脫 去，從而大量的含油汙水就產生了。采油汙水是油田汙水的主要組成部分，隨著 含油汙水的大量增加，需要按照國家有關水質標準對汙水進行合理的排放和處 理，否則會對油田生產產生阻礙並會對受納水體、土壤等產生潛移性侵害，超過 環境容量後對生態環境產生危害[1]。
大量的汙水經汙水廠處理，去除或降低汙染物含量達標後，進行回注。但隨 著隨著汙水量規模的增大，已超出注入水量要求，相當一部分含油汙水必須外排。 在聚驅采油過程中，高含水後期是我國各大油田生產的現狀，由於聚合物的使用， 需要低礦化度的清水配製聚合物溶液，致使大量外源清水注入係統，從而會使產 出的汙水無法全部回注。同時由於汙水處理工藝比較落後，大量汙水的不達標外 排；另外由於油水井作業及洗井汙水的無處理外排也對環境造成嚴重汙染 。
聚合物驅，在保證我國油田原油穩產中發揮著不可替代的重要作用，但由於 聚合物的穩定性，在采出水中大量的聚合物分子仍然存在，而經油水分離後產生 的汙水相對粘度較大，容易形成的比較穩定的乳液，致使水相中含油量偏高，從 而使汙水處理難度增加。
1.1油田汙水組成
1.1.1油田采出水
在采油過程中，石油的主要天然伴生物是水。在油藏開采初期，自噴采油過 程中，采出原油含水率較低。但是如果油藏密閉良好，隨著原始地層能量遞減， 自噴采油方式將難以繼續。為了提高采收率，則向地層進行注水或注氣的方式來 提供能量。注水開發方式應用較廣，但隨著開發時間的延長，注入水與原油一起 采出，使原油含水率不斷增加。油田原油在外輸之前需要將水分控製在一定比例 之下，多餘水分需要脫出。在原油脫水站處進行油水分離處理就會產生出大量的 汙水，而汙水中主要汙染物之一就是原油，通常將在油田開發過程中產生的此類 汙水稱為油田采出水。油田采出水除含有原油外，還包括從地層中隨原油一起攜 帶至地麵的各種無機鹽、有機物以及懸浮顆粒等。
在油田的中後期注水開發時期，油田助劑有相當規模的應用，添加各種性質 的助劑對注入水進行改性處理，改性注水是保持油田地層壓力、提高采油率的必 要措施。而化學驅主要包括：聚合物驅，通過在注入水中加入高聚物來改善水的 驅油和波及性能進而提高原油采收率的方法；堿驅，以堿（氫氧化鈉、原矽酸鈉、 矽酸鈉、碳酸鈉等）的水溶液作為驅油劑的方法；表麵活性劑驅，用表麵活性劑 體係作為驅油介質的驅油方法；複合驅，兩種或兩種以上的驅油成分組合起來的 驅動；混相驅，以混相注入劑（注入地層後在一定條件下能與原油混相的物質） 作為驅動介質的方法。
由於注入水中添加有各種助劑，以上所述各種化學試劑則會在采出水中以各 種形式存在。改變注入水，使油田采出液含水量不斷增加、成分更加複雜。油田 采出水是一種以水為主體，水體中含有固體雜質、各種形態的油類、無機鹽離子、 有機物、微生物以及溶解氣體類等物質。通過對國內主要油田汙水水樣的分析， 發現具有如下特點：礦化度高、含油量高、含有大量易於結垢離子、懸浮顆粒類 含量高、含添加劑（聚合物） 。
目前，我國陸上大油田如大慶油田、長慶油田、遼河油田等，已經走過自噴 采油階段而陸續進入中後期開采階段，中後期生產的一大特點就是高含水率，大 慶油田部分處於開采後期的板塊[4]，油井采出液的油水比低於1:9。注入水和改 性注入水是采出液中含水率升高的主要原因，從而導致大量多餘采油汙水的產 生。特別是聚合物驅油技術成熟應用，在提高采收率的同時，采出水中殘留的高 濃度聚合物分子導致汙水處理難度進一步加大。回注水質不達標，有可能導致堵 塞滲油口、管線易腐蝕結垢、注水壓力升高等一係列問題[5]。因此，油田汙水處 理是國內外研究的熱點，利用新技術、新工藝對采油汙水進行有效處理，使之達 到回注及外排的水質標準，是目前油田開發生產的重要任務之一。
1.1.2鑽井汙水
鑽井汙水是鑽井過程中產生的廢水，主要是鑽井液的高倍稀釋所形成的混合 物。鑽井液是指鑽井中使用的工作流體，它可以是液體或氣體，主要是用來衝洗 井底、攜帶岩屑、平衡地層壓力、冷卻與潤滑鑽頭等。鑽井液由分散介質（水、 油或氣體)、分散相（粘土、油、水或氣體)、鑽井液處理劑（酸、堿、鹽表麵活 性劑等）組成。
目前國內油田鑽井過程使用的鑽井液體係主要包括：鈣鹽處理鑽井液體係、 聚合物鑽井液體係和磺酸化鑽井液體係[6]。鈣鹽處理鑽井液主要由水溶性鈣鹽、 燒堿、清水、泥漿稀釋劑及降失水劑等有機處理劑組成；聚合物泥漿主要是由清 水、聚合物類（聚丙烯酰胺、聚丙烯酸鹽等）處理劑組成；磺酸化泥漿體係主要 是由清水、搬土、燒堿和各種有機處理劑組成。
鑽井汙水主要由以下三部分組成[7]:①地麵廢水，它是由油井場地表麵的雨 水衝刷匯集而成，主要組成為地表的泥沙、少量的殘油、鑽井液等。②鑽井過程 中衝洗動力設備而產生的汙水，其中主要汙染物為石油類和少量的鑽井液。③鑽 井機械設備廢水和井底返回水，即洗井液，它是由衝洗砂樣，鑽井機械設備及鑽 井返回地麵的水產生的，其中汙染物主要是鑽井液，這部分廢水量大，組成複雜。
在目前油田鑽井開發過程中，現有的泥漿體係不可能從開鑽直至完鑽都能完 全適應鑽井全過程的要求，中途需要多次倒換鑽井液體係，在此過程中，許多泥 漿會從井中溢出，從而失去可利用性，產生大量的廢棄泥漿，而這部分廢棄泥漿 幾乎完全排向汙水池，致使廢水中的各種有害物的濃度激增。鑽井汙水雖然來源 於上述三大部分，但最終的成份遠比上述分析的複雜且濃度很高。從某種意義上 講，鑽井汙水是稀釋後的鑽井泥漿[8]，鑽井汙水的汙染物主要包括鑽屑、石油、
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粘土、聚合物、有機和無機助劑、重金屬等。鑽井汙水具有高度不穩定性、多變 性、複雜性和分散性等特點。 1.1.3其它類型汙水
采出水和鑽井液是油田汙水的主要組成部分，而油田生產過程中產生的任何 含油或含有其它汙染物的水體都是油田汙水的組成部分，例如對油田生產設備、 儲運工具進行清洗，地表徑流衝刷生產板塊而產生的含油汙水等；另外由於發生 事故而造成原油泄漏進入水體也構成汙水[9]。油田是消耗水資源的大戶，也可以 說油田是產生汙水的大戶，由於油田地質條件差異及生產差異性，各油田汙水處 理站要處理的汙水水質差異大，而且水質變化大，油田汙水處理任務仍十分艱巨。
1.1.4油田汙水水質成分
油田汙水中存在的物質成分，可以粗略分為五類，主要包括[10，11]:
(1)懸浮物質：①粘土和各種粒徑的砂粒；②因腐蝕而產生的鎊或汙垢：鐵 鏽、水垢、硫化物、鈣鹽等；③微生物：主要是硫酸鹽還原菌（SRB)和腐生菌
(TGB);④油分中沸點高而不溶的錯質、膠質浙青質等。
(2)膠體：粒徑為1x1〇-3〜1pm。水體中大分子物質或有細微結構的有機物會 形成膠體，並吸附部分粘土顆粒和微生物等，類似於懸浮物質。
(3)浮油和分散油：采出水中的原油大部分在水麵形成浮油，並有部分以小 顆粒狀分散於水體中形成分散油。
(4)溶解油和乳化油：油田采出水中約有10%比例的原油以乳化狀態存在。 還有極少比例的原油的呈溶解態。
(5)溶解物質：部分小分子物質及離子在水中處於溶解狀態，主要包括：① 溶解在水中的無機鹽類。基本上以陽離子的形式存在，油田采出水的礦化度一般 都會很高；②溶解氣體。如硫化氫、二氧化碳、氧氣、烴類氣體等。
油田汙水是一個複雜的體係，一般具有以下特征[12-14]:
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Table 1-1 Sewage characteristics
含油量高礦化度高細菌 DO低COD高 pH偏高
>1g/L20-50g/LSRB、TGB -可達幾萬 mg/L>7.5
1.2油田汙水處理存在的問題
油田汙水處理的難易程度隨其來源及油汙的狀態和組成不同而有差異。采油 汙水處理方法按原理可分為物理法，化學法，物理化學法，生物法等[15]。從前麵 描述可知，油田汙水中的原油會以多種狀態存在，而且汙水中還含有其他雜質， 單一方法通常達不到良好的處理效果[16]。要使油田汙水達到排放或利用的標準， 各油田目前在汙水治理上存在以下主要問題[17]:
(1)我國主要陸上油田進入高含水後期，油田產生大量汙水需要外排。一方 麵由於注入水中添加聚合物後，需用低礦化度的清水來配製聚合物溶液，注入水 係統中則引入大量的清水水源，導致供水、注水係統不平衡，產出的汙水無法全 部回注，同時由於汙水處理工藝比較落後，大部分采出水達不到排放標準直接外 排造成環境汙染；另一方麵，在油水井作業及洗井過程中，產生的汙水無處理就 地外排，對環境汙染嚴重。
(2)采出水成分日趨複雜化，處理難度加大。聚合物驅和其他二元、多元化 學驅油相繼開展。由於聚驅采出水中含有一定濃度的聚合物分子，分離出來的汙 水相對粘度較大，易於形成穩定的乳化油，使油水分離難度加大。另外在油田開 發生產過程中，地麵工藝加入的破乳劑、緩蝕劑、防垢劑，采油工藝加入的殺菌 劑、防蠟劑和其它工段加入的酸堿、有機物等都會隨之集中於汙水處理站。汙水 沉降時間長、加藥量增多、過濾壓力升高、反衝洗時間延長、反衝洗周期縮短、 水驅汙水站處理能力下降等。
(3)從深度汙水處理技術來看，我國各主要油田處理技術相對落後，使得水 處理過程中懸浮物含量超標、懸浮物粒徑不合格的現象很普遍。急需找一種采出 水專用的精細過濾設備。
(4)從采出水除油設備來看，各主要油田多采用的是重力沉降罐。氣浮、水 力旋流及壓力沉降等除油設備隻有少量應用。地麵設施龐大、工藝複雜、生產成
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本高、建設改造費用大，已不能適應高含水後期油田開發的需要。
1.3 PAM在采油中的應用及對水質的影響
1.3.1聚丙烯酰胺的化學特性及應用
聚丙烯酰胺是一種線型高分子聚合物，碳鏈骨架上連接有酰胺基或羧基，易 形成氫鍵，使PAM分子有著良好的水溶性及較高的化學活性[18]，並能通過枝接、 交聯作用形成改性聚合物，從而PAM本身和其一係列的衍生物具有多種使用特 性，比如將PAM作為絮凝劑、增溶劑、表麵活性劑使用等。其中PAM在工業 中的應用性質[19-21]有以下幾個：
表1-2 PAM性質 Table 1-2 Characteristics of PAM
性質表現形式
水溶性易溶於水，與不溶於水的高分子改性橋接增加其水溶性
增粘性分子量高，水溶液粘度高；與水溶液中的其它分散劑發生作用而增粘
流變性剪切稀釋性、剪切增稠性、觸變性
分散作用降低水的表麵張力、增加溶液的潤濕性、阻止顆粒聚並
絮凝作用使懸浮物質通過電中和、架橋吸附作用絮凝
減阻作用有效降低流體的摩擦阻力，降阻50%-60%
如上表所述，高分子化合物聚丙烯酰胺的獨特性質決定了它的廣泛應用，因 而聚丙烯酰胺又被稱為“百業助劑，，[22,23]。
PAM在聚合物驅采油、水處理等行業也具有廣泛的應用，在石油開采中， 聚合物驅提高采油率和鑽井液材料均用到聚丙烯酰胺，不同結構種類的聚丙烯酰 胺具有不同的性質，根據其功能性應用於鑽井、壓裂、強化采油等各個作業工段。 我國陸上油田包括大慶油田、勝利油田等開采已經步入中後期，主要通過在注入 水中添加陰離子聚丙烯酰胺水來改善油水流度比，提高原油采收率，並推廣聚合 物驅油和三元複合驅油技術[24]。
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H H
I I
C—C
I I
HC=O
x
C一C_
I I
H ^=O
y
HH
聚合物驅是以聚合物溶液作為驅油劑的驅油法，也稱為聚合物強化水驅、聚 合物溶液驅、增粘水驅和稠化水驅。應用於驅油主要為部分水解聚丙烯酰胺 (HPAM)其分子結構[25]如下：
NH2
圖1-1 HPAM分子結構 Fig.1-1 The molecular structure of HPAM
聚合物驅較普通水驅能提高采收率5%-15%。一方麵，聚合物驅主要是利用 聚合物增加注入水的粘度，降低油水流度比，從而增大注入水的波及係數。聚合 物對水的稠化能力產生原因：（1)濃度增大後，聚合物長鏈分子會糾纏在一起， 產生結構粘度；（2)聚合物分子鏈段中含有親水基團，溶劑化增粘；（3)離子型 聚合物在水中離解形成雙電層，互相吸引增粘能力顯著。另一方麵，在常見親水 地層，聚合物通過色散力、氫鍵等作用力容易吸附在岩石表麵。當注入水通過時， 吸附層薄膜發生膨脹，降低了水相通過岩層的有效滲透率，吸附層與油層接觸時 則不會出現膨脹現象。因此，在含油飽和度很低的油層中改聚合物溶液驅油，可 顯著降低水的流動度，減弱其舌進、指進的趨勢，最終達到提高采油率的目的。
1.3.2聚合物驅采油汙水
聚合物驅油技術從國外引進，在“八五”期間被列為國家科技攻關項目，自 “九五”之後，聚合物驅油技術在我國陸地各大油田開采麵積及產量不斷增加， 在保證我國油田穩定產油中發揮著重要作用。例如在大慶油田2006年油田生產 總產量中，聚合物驅原油產量為總量的27%。聚合物驅在給油田帶來可觀效益的 同時，也帶來亟待處理的問題，主要就是采出水達標外排的問題。聚合物驅是一 種改性水驅，因而與水驅采出汙水相比，聚驅采出汙水的性質也相應的會發生變 化，大量的聚合物存在，使汙水含油量增高，處理難度加大。總的來說油田采出 水中聚丙烯酰胺的存在，會對含油汙水處理造成以下影響[26-28]:
①采出水中聚丙烯酰胺的存在，增加的汙水粘度。普通水驅采出水的粘度一 般為0.6mPa.s(45°C)，聚合物含量越高，米出汙水的粘度也越大，一般聚驅米出
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水的粘度範圍約為0.8〜1.1mPa.s(45°C);聚丙烯酰胺大分子結構易於與水體中的 膠體顆粒通過吸附等作用，增加懸浮物的穩定性，從而使汙水處理自然沉降時間 相對延長。
②采出水中油珠粒徑相對減小。粒徑測試發現：聚丙烯酰胺的存在會使采出 汙水中90%的油珠粒徑小於10pm；另外微觀測試結果表明：采出水中的小油珠 穩定存在是因為聚合物分子增大了油珠界麵電荷和油水界麵膜強度。
③由於陰離子型聚丙烯酰胺的存在，會使部分絮凝劑作用效果變差，從而需 要投加更多的藥劑。經常規工藝處理，處理後的汙水中懸浮固體顆粒、原油濃度 等指標難以達到原有水質標準，甚至會嚴重超標。
④聚合物溶液吸附並攜帶大量泥沙量。利用聚合物的性質，增加水溶液對原 油的作用力，而同時溶液也會將泥沙等固體顆粒吸附，大量泥沙的存在縮短了汙 水站反衝洗周期，增加了工作量，從而能也就降低了汙水處理廠的處理效率。 1.3.3水質標準
油田采出水經處理後回注或外排，目前我國現行的聚合物驅汙水回注標準主 要依照國標（GB 8978-1996) [29]如表:
表1-3聚合物驅汙水水質回注標準 Table 1-3 Rejection standard of polymer flooding swage
滲透率/^m2<0.10.1-0.6>0.6
油含量/mg • L-1彡 10.0<15.0<30.0
懸浮固體含量/mg • L-1彡5.0<15.0<30.0
顆粒粒徑中值/^m彡2.0彡3.0<5.0
聚合物驅汙水經處理之後外排，則執行國家汙水外排指標。處理後的油田汙 水一般應達到一級排放標準。
表1-4汙水綜合排放指標 Table 1-4 Sewage discharge index
汙染物一級標準二級標準三級標準
石油類（mg/L)101030
懸浮物（mg/L)70200400
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COD (mg/L)100150500
氨氮（mg/L)1225-
揮發酚（mg/L)0.50.52.0
pH6-96-96-9
根據對三次采油廢水的水質資料和水質特征的分析，三次采油汙水中，聚合 物驅采出水的粘度隨HPAM含量的增加而增加，HPAM分子上的酞胺基吸附水 中的油滴和懸浮物，並包裹在顆粒表麵，增加了其穩定性。在利用微生物處理三 次采油汙水，聚合物和原油是主要的作用對象。大慶某油田經汙水處理站處理後 的汙水水質如下表：
表1-5聚合物驅采油汙水的主要參數
Table 1-5 The main index of polymer flooding sewage
分析項目水質參數
油濃度/mg • L-17.5-35.6
懸浮物濃度/mg • L-110.0-33.2
顆粒粒徑種植/p2.8-8.0
PAM 濃度/mg • L-194-181
COD/mg • L-1326-538
pH8.5-9.2
總礦化度/mg • L-13268-4593
上述表中的主要參數表明，原油是聚合物驅采油汙水的主要汙染物之一，是 汙水COD和BOD的主要組成。汙水中的原油和COD均已超出外排標準。
1.4聚合物驅含油汙水的微生物處理
1.4.1生物修複
按照汙水處理的原理可以粗略分類如下[30]:
表1-6汙水處理方法 Table 1-6 Sewage treatment method
方法具體分類
物理法重力分離法、粗粒化法、過濾法、膜分離法等
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化學破乳、化學氧化、光氧化等
化學法 物理化學法 生物法
氣浮浮選法、吸附法、磁吸附分離法、電化學法等
好氧活性汙泥法、接觸氧化法、厭氧法、氧化塘法等
從原理上看，處理含油汙水的方法較多。各種處理方法都具有實用性和局限 性，在實際汙水處理過程中，通常是多種方法結合，使出水達到排放標準。在本 論文中主要探討生物法在處理含油汙水方麵的應用。可以將微生物修複定義為： 生物修複是指生物特別是微生物催化降解有機物，修複或消除環境中的汙染物的 一個自發或受控進行的過程。國內外研究者對生物修複的一些優點、使用條件及 處理措施進行了歸納 ，如下表1-7。
生物修複的優點
前提條件
基本措施
表1-7生物修複 Table 1-7 Bioremediation
經濟實惠
對環境二次汙染小 能盡可能降低汙染物濃度 原位修複中汙染物可就地 清除，操作簡便
具有代謝活性的微生物接種高效降解菌
必要的降解速率及去除程度添加營養物質
汙染物可被利用，代謝產物沒有毒性提供必要的電子受體 汙染場地或反應器必須利於微生物生必要時需添加
長和保持活性表麵活性劑
14.2微生物對原油的降解
石油汙染的修複的基礎則是石油烴類化合物的生物降解，其三個必要條件 為：石油烴類的存在、石油烴類降解為生物和適宜的微生物生長的代謝條件。在 環境中能夠降解石油烴類的汙染物主要有細菌、黴菌和酵母菌等：
表1-8石油烴降解菌
Table 1-8 Petroleum hydrocarbon degrading bacteria
黴菌（Fwsar/wm)
酵母菌假絲酵母屬（C^J/_JQ)、紅酵母屬（仙oJo如owfo)、擲抱酵母屬
微生物作為汙染修複的載體，不同種類的微生物製約著修複的效率，而原油 組分第變化也會對生物降解產生影響。石油烴類的主要成分是烷烴、芳香烴和環 烷烴。因為結構不同所以各種烴類的降解難易程度也是不同的。原油生物降解的 先後順序為：烷烴>芳香烴>環烷烴。而沒有支鏈基團的正構烷烴則比異構烷烴 易於被微生物利用。微生物難於降解芳香烴，如苯的生物降解進行較為困難。
石油烴類微生物發生降解，除了具有合適的微生物和石油烴以外，還需要適 宜的微生物和微生物生長代謝的適宜條件，國內外環境工作者從環境因素方麵對 采油汙水生物降解處理進行了大量的研究，雷雲[32]等通過對取自不同地方的汙泥 篩選研究試驗，得到一株細菌去油率達到83.5%。周東凱[33]從土壤中篩選培養得 到PD-1菌株，該菌株能在常溫下及較短時間內高效地降解原油，推廣應用的潛 力較高。楊二輝[34]篩選得到一株能在高溫條件下對采油汙水中的烴類有機物具有 獨特降解作用的菌種，他在中試試驗中采用生物接觸氧化膜法對采油汙水進行處 理，在60°C高溫條件下，該菌株對含油汙水中的石油烴仍具有良好的代謝去除 效果。而Anne Gunn Rike[35]從北極土壤中篩選出的土著嗜油菌，在5〜20 °C低 溫條件下仍具有新陳代謝的能力。彭鴿威[36]則從大港油田的石油汙染土壤中篩選 出一株高效原油降解菌株X3,研究了該菌株在不同pH和鹽度條件下對原油的 降解能力，同時還探討底物濃度（原油）對細菌生長和降解率的影響，其研究結 果表明該菌株具有一定的耐堿性和耐鹽性。陳莉[37]從勝利油田石油汙染土壤中分 離得到一株細菌A-1，該菌在鹽濃度達到10-20 g • L-1仍對原油中的環烷烴成分 具有降解效果。Rahman[38]則究了 pH值對降解的影響，得到一株耐堿菌，該菌 在pH值8.5時得到最大降解率為43%。Lu M[39]在處理油田采出水時，向其中添 加玉米粉作為營養補充提高了微生物的環境適應能力，從而提高了對原油的降解 效果。混合菌通常相對於單菌具有較好的處理效果，李偉光[40]等篩選得到39株 對原油具有降解能力的細菌，通過研究表明不同菌株混合培養對原油的降解能力 及耐受力明顯大於單一菌株，而且全混合菌株的耐受力最強，表明混合菌在降解 原油時具有一定的協同作用，各菌株的共代謝作用提高了全混合菌對環境的適應 力。
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總的來說，影響微生物對原油的生物降解的幾個主要因素[30]為:
表1-9生物降解影響因素 Table 1-9 Impact factors of oil biodegradation
因素影響原因
原油物理狀態微生物在油水界麵上活動，原油分散成都影響油水界麵麵積 溫度溫度影響是遊艇的物理狀態、化學組成和微生物生長及酶活性
營養物質微生物生長代謝需要合適的營養元素比例，原油提供碳源
氧氣石油烴生物降解是好氧過程，水體溶解氧製約微生物生長
pH細菌、放線菌事適宜中性或偏堿環境，酵母菌、黴菌適宜偏酸
酸堿度影響微生物代謝及酶活性 鹽度對滲透壓產生影響，影響細胞質膜的通透性
汙染物濃度高濃度汙染物對微生物具有毒性，而過低濃度的汙染物無法被攝取
1.4.3微生物對聚丙烯酰胺的降解
聚合物驅過程中使用的主要為陰離子聚丙烯酰胺，因為非離子型聚丙烯酰胺 進行水解即可得到陰離子聚丙烯酰胺，所以通常將其稱為部分水解聚丙烯酰胺 (HPAM)。對陰離子聚丙烯酰胺具有降解能力的微生物也很多包括古菌、真菌、 細菌和放線菌等。在研究初期，國外研究者對丙烯酰胺單體[41]、丙烯酰胺二聚體 一直到七聚體[42]的生物降解進行了研究，表明細菌能將單體降解為丙烯酸和氨並 最終完全降解，多聚體可以被部分降解。基於對於脂肪族酰胺類的研究 Kay-Shoemake等[43]考察了對陰離子聚丙烯酰胺的微生物降解進行了研究， Kay-Shoemake的實驗研究表明，聚合物分子上的氨基易於作為氮源被微生物利 用[44]。
而對於聚丙烯酰胺，它的相對分子量很大而且分子骨架為長碳鏈結構，對於 微生物降解具有較強抗性，而在驅油中應用時也正需要聚丙烯酰胺分子的穩定 性。在近年來對於聚丙烯酰胺的微生物降解的研究過程中，研究人員曾認為聚丙 烯酰胺分子隻能其測量氨基能微生物降解。在後續的研究中篩選到很多能以陰離 子聚丙烯酰胺為碳源的菌株。李宜強[45]、包木太等[46]和劉永建等[47,48]對聚合物 驅汙水中的部分水解聚丙烯酰胺(HPAM)進行了降解實驗，研究表明HPAM的氨
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基和碳骨架可以被部分降解。
1.4.4PAM的存在對微生物降解原油的影響
雖然目前國內外對於聚丙烯酰胺的生物降解進行了大量研究，特別是在國內 此類研究主要側重於對於驅油用部分水解聚丙烯酰胺的生物降解，但從總體效果 來說，微生物對於高聚物的降解能力還是有限，聚丙烯酰胺正式由於其具有將強 穩定相才能在地層複雜環境中得以應用。在處理聚合物驅汙水時，聚丙烯酰胺和 原油總是同時存在的，也有人篩選得到對原油和HPAM同時具有降解能力的菌 株，在本論文中主要探討在聚丙烯酰胺存在條件下，微生物對於原油的降解情況。 在前麵的章節已經提到，聚丙烯酰胺的存在會使溶液性質發生一係列的變化。微 生物對原油的生物降解是發生在油水界麵上的，溶液性質的改變就會影響到原油 的分散狀態及微生物的生長代謝從而對降解過程產生影響。
1.5論文研究的目的、內容和擬解決的問題
1.5.1研究目的
通過上述分析可以看出，在聚合物驅含油汙水中，原油和PAM是生化處理 的主要對象，聚合物通常比較難以處理，而聚合物的存在增加了汙染物的穩定性， 對含油汙水的水質性質產生較大影響，而微生物在用於對油田汙水的處理的過程 中受到各種因素影響。通過對微生物、聚丙烯酰胺和原油的相互作用，在含聚丙 烯酰胺環境中考察微生物對原油的降解作用。活化實驗室高效降解原油菌株，優 化發酵培養條件，在不同水質條件下考察細菌對原油的降解作用；考察原油與聚 丙烯酰胺之間的相互作用；考察在聚丙烯酰胺存在條件下微生物對聚丙烯酰胺的 降解作用；通過發酵罐模擬實驗，對含聚丙烯酰胺體係中細菌對原油的降解作用 進行動態跟蹤。
1.5.2主要研究內容
(1)聚丙烯酰胺的濃度檢測方法及聚丙烯酰胺溶液中原油的回收率
實驗過程中使用的是采油用的部分水解聚丙烯酰胺（HPAM)，對汙水中
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HPAM的濃度測定有多種方法，實驗過程中隊幾種常用方法進行比較。然後考察 HPAM溶液中原油經石油醚萃取的回收效果，以部分的反映HAPM對原油的作 用。主要考察HAPM溶液粘度變化時原油的回收率變化，通過改變HAPM濃度、 加入無機鹽、調節酸堿度、滅菌和機械剪切等途徑改變粘度。並對汙水中原油濃 度、HPAM濃度的測定方法進行探討。
(2)高效降解原油菌株的篩選與培養條件優化
將實驗室保存的對原油具有降解效果的菌株PM、B-1、D3-2菌株進行活化 培養，另從勝利油田汙水中篩選得到三株降解原油的細菌。比較其對原油的降解 效果，並選擇合適菌株進行後續降解實驗。采用單因素實驗方案考察菌株在不同 碳源、氮源、溫度、pH值等條件下對原油的降解效果，從而確定細菌降解原油 的最佳培養條件。探討加入HAPM之後，對微生物生長的影響及對原油降解率的 影響。
(3)發酵罐模擬含聚丙烯酰胺汙水中細菌對原油生物降解
利用發酵罐發酵微生物降解含油汙水，實時監測在聚丙烯酰胺環境中細菌對 原油的降解過程，對菌濃、發酵液表麵張力、溶液粘度、HAPM濃度、pH等因素 進行檢測。並最終對各個時期原油組分進行分析。
15.3擬解決的問題
(1)汙水中聚丙烯酰胺濃度測測定方法比較，HPAM溶液中原油的回收率
(2)對原油具有降解能力的菌株的篩選
(3)聚丙烯酰胺的存在對細菌生長的影響
(4)聚丙烯酰胺環境中，細菌降解原油的過程動態監測
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2.HPAM濃度的測定方法及HPAM溶液中原油的回收率
2.1前言
從前文可以看出油田聚合物驅汙水中含有聚丙烯酰胺（後文所稱聚丙烯酰胺 均為部分水解聚丙烯酰胺）等化學助劑。采出液含聚後，汙水性質發生了一些變 化，例如：采出水的粘度增加；分散油珠粒徑變小；油水界麵膜強度增大，界麵 電荷增強；采出水中小油珠穩定的存在於水體中；采出液受剪切作用很容易進一 步乳化，油珠之間聚合成大油珠的能力下降。
聚丙烯酰胺從一定程度上導致油水分離困難，增加了含油汙水處理的難度。 因此，聚合物驅采出水的達標外排處理工藝，是目前我國油田地麵汙水處理工藝 研究的熱點之一。含聚油田采出水成分複雜，降油微生物生長的環境也趨於複雜。 聚合物驅油汙水中的聚丙烯酰胺和原油是實驗研究的主要對象。聚合物驅汙水中 的聚合物濃度是水質檢測的一個重要指標，目前國內外測量聚丙烯酰胺濃度的方 法主要有：澱粉一碘化鎘法、濁度法、粘度法、導數紫外光譜法、分子尺寸排阻 色譜法、化學發光定氮法、超濾濃縮薄膜幹燥法、氨電極法、熒光分光光度法、 共振散射光譜法、放射性同位素標記法、量熱法等等。
本部分討論了幾種常用的HPAM測定方法，對它們的適用性進行了比較。並 通過模擬聚合物驅汙水，通過石油醚萃取汙水中的原油，來初步探索聚合物乳液 中原油的回收率變化，以期為含聚汙水處理提供理論依據。
2.2材料和方法
2.2.1實驗材料及試劑
2.2.1.1實驗儀器
儀器名稱生產廠家
LDZX-50FAS立式電熱壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠
SHA-C水浴恒溫振蕩器江蘇金壇中大儀器廠
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UV-2450紫外分光光度計日本島津
YS100顯微鏡日本Nikon
YT-CJ-1ND型潔淨工作台北京亞泰科隆實驗科技開發中心
78-1磁力加熱攪拌器金壇市雙捷實驗儀器廠
SZ-1快速混勻儀江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠
DHG-9053電熱恒溫鼓風幹燥箱上海山連實驗設備有限公司
pH計HANNA Instruments
BL-2200H電子天平曰本島津
烏氏粘度計(0.-0.6mm)國藥集團化學試劑有限公司
烏氏粘度計(0.58mm)上海申立玻璃儀器有限公司
烏氏粘度計(0.73mm)上海申立玻璃儀器有限公司
精密增力電動攪拌器常州國華電器有限公司
2.2.1.2實驗試劑
試劑生產廠家純度規格
NaCl國藥化學試劑有限公司AR250g
NaNO3國藥化學試劑有限公司AR250g
石油醚國藥化學試劑有限公司AR250g
可溶性澱粉天津市天泰精細化工有限公司AR1 kg
碘化鎘上海天蓮精細化工有限公司AR500 g
溴水國藥化學試劑有限公司AR500 g
硫酸鋁天津博迪化工有限公司AR500 mL
次氯酸鈉天津廣成化學試劑有限公司AR500 g
甲酸鈉天津市科密毆化學試劑有限公司AR500g
冰醋酸天津廣成化學試劑有限公司AR25 g
乙酸鈉天津市巴斯夫化工有限公司AR25 g
2.2.1.3原油與聚丙烯酰胺:
原油，來自於勝利油田，將原油脫去不溶的浙青等成分，製備成基準油[51]。 基準油的製備：取一定體積的原油加於幹燥的燒杯中，加入與原油體積相等的石 油醚（30-60 °C)將原油溶解，再加入鹽酸（體積比1:1)調節pH值為2。使原
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油充分溶解於石油醚中，將溶液靜置待其分層。收集上層石油醚萃取液於錐形瓶 中，棄去下層不溶物質。在分離得到的原油的石油醚溶液中加入無水硫酸鈉粉末 直至加到不再結塊為止，放置2個小時以上使溶液中殘餘水分基本脫去。用快速 定性濾紙將不溶物濾去，濾液收集於燒瓶中，在旋轉蒸發儀上低溫蒸餾回收大部 分石油醚，待石油醚蒸發完後，將剩餘粘稠的原油液體轉移到入幹淨燒杯中，在 45±1°C的恒溫水浴上將其蒸發近幹後，放入45±1°C烘箱中烘至恒重，此時剩餘 原油即為基準油。將基準油密封保存。
部分水解聚丙烯酰胺（HPAM):水解度<20%，相對分子量>500萬，實驗過 程中利用烏氏粘度計法測定HPAM的相對分子量。圖2-1為HPAM的分子結構。
圖2-1 HPAM分子結構 Fig.2-1 The molecular structure of HPAM
聚丙烯酰胺
2.2.2原油濃度測定方法
紫外分光光度法測定原油濃度：用容量瓶配製1000mg_L-1的基準油儲備液， 取10隻幹燥的50 mL具塞的刻度比色管，用吸量管分別加入基準油儲備液0.00、
0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00mL，用石油醚稀 釋到刻度。此標準係列的濃度分別是0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 和100 mg/L。用紫外分光光度計測出原油溶液在190-400nm之間的最大吸收峰， 然後分別測定各濃度的溶液在最大吸收波長下吸光度，以濃度（mg_L-1)為橫坐 標，吸光度為縱坐標，繪製原油濃度(mg_L-1)-吸光度標準曲線。
將含油汙水全部轉入分液漏鬥中，同時用30 mL石油醚分三次洗滌容器， 將石油醚轉入分液漏鬥中。分液漏鬥充分震蕩，放氣，靜置分層，將下層水溶液 放出，收集上層溶液後，用10 mL石油醚洗滌分液漏鬥1次，合並上層液[52]， 將原油的石油醚溶液轉入1隻50mL的比色管中，加入石油醚到刻度線，混合均 勻。用移液管吸取1mL的稀釋液轉入25 mL比色管中，用石油醚稀釋到刻度線，
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混合均勻。用紫外分光光度計在最大吸收波長下測定吸光度，通過原油濃度標準 曲線計算得出原油濃度[53]
2 2 3 HPAM濃度測定方法
本論文討論了澱粉-碘化鎘法、濁度法、粘度法、導數紫外光譜法四種常用 的測量HPAM濃度方法。通過分別繪製標準曲線，比較了四種方法的精密度和 準確度，以及實驗的重複性，討論了方法的應用範圍。
取適量HPAM於烘箱中在80°C下烘幹12小時，在燒杯中加入1000mL蒸餾 水，將機械攪拌器葉輪置於燒杯中心，開啟攪拌調速形成漩渦，稱取 0.5000gHPAM，沿著漩渦斜麵逐漸加入，攪拌90min，放置過夜後保存於棕色試 劑瓶。同樣方法用自來水做溶劑配製1000mLHPAM溶液，另過濾1L含聚丙烯 酰胺的大慶油田汙水備用。
2.2.3.1澱粉一碘化鎘法[54-57]
(1)將500 mg-L-1聚丙烯酰胺溶液在25mL比色管中，用蒸餾水分別配製成50、 100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚丙烯酰胺溶液；預 先配置好pH=3.5的醋酸緩衝溶液、甲酸鈉溶液及澱粉碘化鎘溶液。
(2) 在11隻50mL的具塞比色管中分別加如5mL pH為3.5的醋酸緩衝溶（其 中含有1個空白作為參比）；
(3)在各比色管中，加入1mL不同濃度梯度的聚丙烯酰胺溶液、然後加入 25-30mL蒸餾水；
(4)加入1mL飽和溴水，混合均勻，進行反應15分鍾；
(5)加入5mL甲酸鈉溶液，待溶液中的黃色褪去後再混合均勻，反應5分鍾， 至顏色完全褪去；
(6)加入5mL澱粉-碘化鎘溶液進行顯色，並加入蒸餾水至刻度，混合均勻；
(7)靜置顯色18分鍾後，在585nm波長下依次測定溶液的吸光度，用聚合物 溶液濃度為0的比色管作為參比溶液；
(8)用自來水做溶劑，重新測定。測定出大慶水HPAM濃度，並用蒸餾水分別 配製成 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚合物溶
液測定標準曲線。
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2.2.3.2濁度法[58-61]
(1) 將用用蒸餾水配製好的500 mg.L-1的聚丙烯酰胺溶液於25mL比色管中， 用蒸餾水分別配製成 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚合物溶液各25mL；預先配製好5mol/L冰醋酸溶液和3.1g/L的次氯酸鈉水
溶液。
(2) 加5mL上述配製的聚丙烯酰胺溶液於11個50mL的比色管中（1個空白參 比)；
(3)用移液管加入10mL的冰醋酸溶液，振蕩混勻，放置2min;
(4)再加入15mL的次氯酸鈉溶液，振蕩均勻；
(5)30min之後，使用可見光分光光度計在470nm波長下測定溶液的吸光度， 用蒸餾水做參比，製作吸光度-濃度關係曲線；
(6)用自來水做溶劑，重新測定。測定出大慶水HPAM濃度，並用蒸餾水分別 配製成 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚合物溶
液測定標準曲線。
2.2.3.3粘度法[62-63]
1.粘度法測定HPAM的相對分子質量：
圖2-2烏氏粘度計測定方法
Fig.2-2 Method for viscosity measuring by Ubbelohde viscometer
具體實驗操作如下：
(1)使用鉻酸洗液將烏氏粘度計洗幹淨，依次用自來水、蒸餾水衝洗粘度計3-5 次，每次都將毛細管部分反複衝洗，放入烘箱幹幹燥備用；
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(2)用鐵架台固定粘度計懸垂於水浴中，調節高度保證液麵沒過1球，並使粘 度計上下垂直，在B、C管位置套上乳膠管，方便操作。調節恒溫水浴溫度為 (30.0±0.1)°C。
(3)用移液管分別移取10mL已知濃度的聚丙烯酰胺溶液和2.5mL的SmohL-1) 的硝酸鈉溶液，由A管注入粘度計中，用洗耳球在C管處向內打氣，以使粘度 計中的溶液充分混勻，此時聚丙烯酰胺溶液的濃度記為C1，靜置10 min恒溫之 後測定溶液流出時間。流出時間測定步驟：用夾子封閉C管處乳膠管，用洗耳 球從B管處吸氣使溶液慢慢從4球、3球經過毛細管充滿2球並上升至1球的 2/3以上位置處封閉B管乳膠管，解去C管的夾子。當放開B管通氣後，溶液會 緩慢從毛細管向下回流。聚丙烯酰胺溶液液麵流經a刻度時，秒表開始記時，直 至液麵降至b刻度時，按停秒表，此時秒表即測得溶液流經a、b刻度送用的時 間，極為溶液的流出時間。重複上述測定過程至少三次，保證三次測得值不超過 0.3 s，三次時間的均值記為t1。
(4)接下來分四次從A管處用移液管移加2.5、2.5、2.5、5.0mL的硝酸鈉溶液(濃 度為1mol.L-1)，將溶液進行稀釋，使聚丙烯酰胺的濃度依次變為C2、C3、C4、 C5,用（3)中所述的方法測定各個濃度的溶液流的平均流出時間t2、t3、t4、t5。 每次向粘度計中加入了硝酸鈉溶液之後，需要充分混勻並抽洗毛細管及1、2球 以保證烏氏粘度計內部各點的濃度一致。
(5)測定溶劑硝酸鈉溶液的流出時間。用蒸餾水反複清洗粘度計，反複流洗粘 度計的毛細管部分。實驗過程中溶液中的硝酸鈉濃度一直為1 mol. L-1，用1 mol- L-1的硝酸鈉溶液將粘度計衝洗1〜2次，然後向粘度計中加入約15 mL的硝 酸鈉溶液（1 mol.L-1)。測出溶劑的流出時間t0。
2.粘度法測定聚丙烯酰胺濃度 具體實驗操作如下：
(1)使用鉻酸洗液將烏氏粘度計洗幹淨，依次用自來水、蒸餾水衝洗粘度計3-5 次，每次都將毛細管部分反複衝洗，放入烘箱幹幹燥備用；
(2)用鐵架台固定粘度計懸垂於水浴中，調節高度保證液麵沒過1球，並使粘 度計上下垂直，在B、C管位置套上乳膠管，方便操作。調節恒溫水浴溫度為 (30.0±0.1)°C。
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(3) 將用蒸餾水配製好的500 mg.L-1的聚丙烯酰胺溶液於25mL比色管中，用 蒸餾水分別配製成 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚合物溶液各25mL；
(4)依次用移液管移取上述各濃度梯度的聚丙烯酰胺溶液15 mL，注入烏氏粘 度計中，用與前麵相同的方法測定出各濃度溶液的流出時間t，作出C-t的工作 曲線。
(5)用自來水做溶劑，重新測定。測定出大慶水HPAM濃度，並用蒸餾水分別 配製成 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚合物溶
液測定工作曲線。
2.2.3.4導數紫外光譜法[64-66]
(1) 將用蒸餾水配製好的500 mg.L-1的聚丙烯酰胺溶液於25mL比色管中，用 蒸餾水分別配製成 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚合物溶液；再將上述濃度聚丙烯酰胺溶液稀釋10倍於50mL的比色管中， 配製成 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg-L-1 的聚合物溶液。
(2)以蒸餾水為參比，用紫外分光光度計測量上述10個溶液的吸光光度值
(3)選擇特定波長求一階導數，繪製標準曲線。
2.2.4原油與HPAM乳狀液的製備及石油回收率的測定方法
部分水解聚丙烯酰胺的存在，會與原油發生乳化，在石油醚萃取原油的過程 中工會形成乳化層，影響測定結果，如果乳化層中的原油不能完全轉移到有機層 中會使含油量測定結果偏低，實驗過程中考察了聚丙烯酰胺溶液中原油的回收
率。
在250mL錐形瓶中加入100mL的HPAM溶液，在錐形瓶中準確加入一定量 的經石油醚溶解的基準油原油，待石油醚揮發完畢後，振蕩錐形瓶，使原有均勻 分散到HPAM溶液中，注意盡量避免將原油沾到瓶壁上。
用石油醚將原油全部萃取，用紫外分光光度計226nm波長下，測定其濃度 為C。在100mL蒸餾水中加入400mg原油，以同樣方法處理後測定其濃度為C0。
原油回收率=C/C0
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2.3結果與討論
2.3.1原油濃度標準曲線
圖2-3原油濃度標準曲線 Fig.2-3 Standard curve for oil concentration
通過紫外方法主要測定原油中芳烴組分的變化，可以部分的反應原油經過生 物降解後的濃度變化。經過測定，原油在226nm波長下，具有最大吸收峰，在 此波長下測得的標準曲線為Y=0.0278X+0.0873 (R2=0.9973)，後續實驗中主要 通過此公式計算原油濃度。
2.3.2 HPAM濃度測定與相對分子質量 2.3.2.1烏氏粘度計的選擇
表2-1烏氏粘度計參數
Table The instrument parameters of Ubbelohde viscomete
毛細管孔徑（mm)0.5-0.60.580.73
粘度計常數（mm2/S2)0.0084460.010360.02197
30°C蒸餾水流出時間（S)99.7179.5537.92
100mg.L-1HPAM 相對粘度2.472.122.31
選擇0.58mm毛細管烏氏粘度計測定HPAM的相對分子量；由於濃度增大後
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溶液流出時間很長，所以選擇0.73mm毛細管測定烏氏粘度計測定粘度曲線，溫 度 30°C。
2. 3. 2.2HPAM的相對分子質量
在30C恒溫水浴中測定HPAM相對分子質量，毛細管孔徑為0.58mm，初始 濃度為1〇〇〇mg • L-1的，測得流出時間，然後計算nsp/C和In nr/C，對聚丙烯 酰胺濃度進行作圖，結果如下圖：
I |_ I1 I• I1 I• I• I~
0.00.10.20.30.40.50.60.7
1.65 n 1.60¬1.55¬1.50¬1.45¬1.40¬1.35¬S 1.30¬1.25¬1.20¬1.15¬1.10
Concentration of HPAM/g^L-1
圖2-4 HPAM相對分子量測定 Fig.2-4 Molecular Weight of HPAM
得到[n]=1.47
根據公式[n]=KMa
30C聚丙烯酰胺的K=37.3X10-6，a=0.66。由此求出粘均分子量M。計算得到其
M=9.184X 106，與所標相對分子量>500萬相符。聚丙烯酰胺的相對分子質量越 大，水溶液的粘度越大，油田使用的部分水解聚丙烯酰胺一般都達到幾百萬，甚 至上千萬分子量。
2.3.2.3濃度測定方法選擇
2.3.2.3.1澱粉碘化鎘法
24
1.6n
水質
R2
蒸餾水 0.9937
自來水
0.9953
汙水 0.9950
^OUBqJosqv
2
4
0100200300400500
Concentration of HPAM/g^L-1
圖2-5澱粉碘化鎘法 Fig.2-5 Starch cadmium iodide method
如上圖，在用澱粉碘化鎘法測定HPAM的濃度時，在以蒸餾水、自來水為 溶劑或者以汙水為底物所的到的標準曲線的線型基本沒有差別，R2都在0.99以 上，線性較為良好。
Fig.2-6 Turbidimetric method
2.3.2.3.2濁度法
圖2-6濁度法
如上圖，在用濁度法測定HPAM的濃度時，在以蒸餾水、自來水為溶劑時
25
的到標準曲線基本一致且R2都在0.99以上。但汙水為底物進行測定時，線性不 好，說明濁度法在測定汙水中HPAM濃度時，容易受到幹擾因素影響，誤差較 大。
2.3.2.3.3粘度法
800¬600- E P
X
400- fc
山
200¬50100150200250300350
Concentration of HPAM
圖2-7粘度法 Fig.2-7 Viscometric method
在用蒸餾水配製的HPAM溶液中，隨著HPAM濃度的增大，其相對粘度呈 指數增長，而非線性增長。由於汙水中存在大量無機鹽離子或其它物質，對溶液 粘度影響很大，用粘度法隻能測定純HPAM溶液的濃度，無法應用於汙水水質 測定。
2.3.2.3.4導數紫外法
26
^OUBqJosqv
^OUBqJosqv
0100200300400500
Concentration of HPAM
圖2-8 HPAM紫外光譜 Fig.2-8 UV spectra of HPAM
圖2-9導數紫外光譜法 Fig.2-9 Method of UV spectra
203A217A217D
R20.95840.95890.9827
當使用自來水配製聚丙烯酰胺溶液或用測定汙水時，溶液在190-300nm範圍 內具有很強的吸收，聚丙烯酰胺吸收峰被掩蓋無法測定，本方法中隻使用蒸餾水 配製聚丙烯酰胺溶液進行了測定。
27
部分水解聚丙烯酰胺水溶液在203nm處具有最大吸收峰，在最大吸收峰處, 繪製吸光度與濃度直線，R2=0.9584沒有較好的線性相關性。在217nm處，吸收 曲線一階導數值具有極值，通過217nm處的吸光度對濃度繪製直線，或繪製一 階導數值-濃度直線，R2分別為0.9589和0.9827,有所提高，但線性相關性仍然 較差。實驗表明導數紫外光譜法測定聚丙烯酰胺濃度的方法適用性並不是太好， 而且由於聚合物驅汙水成分複雜，很多成分都有紫外吸收，對測定幹擾大，這種 方法隻在測定聚丙烯酰胺純溶液時具有一定應用。
通過比較，相較於其它幾種方法，澱粉碘化鎘法測定方法比較繁瑣，但是其 在測定聚丙烯酰胺濃度的過程中，受到幹擾影響小，特別是在測定汙水中聚丙烯 酰胺時仍具有很好的準確度，選擇澱粉碘化鎘法作為後續實驗中測定溶液中 HPAM濃度的方法。
2.4HPAM與原油之間的作用
2. 4.1鹽效應對HPAM溶液相對粘度的作用
烏氏粘度計中，使NaCl濃度維持在2g • L-1或NaN〇3保持在1mol • L-1濃
度，不斷稀釋HPAM溶液使其濃度降低，測定不同濃度下的相對粘度值。得到 如圖結果。對數據進行指數增長擬合。
-1000100 200 300 400 500 600 700
HPAM濃度C/mg.L—1
NaCl 0.99996 NaNO3 0.99998
圖2-10鹽效應對HPAM相對粘度的影響
Fig.2-10 The relative viscosity of HPAM under different concentration of NaCl
28
水體中的Ca2+、Mg2+、Na+、K+等無機鹽離子通過屏蔽效應、降低HPAM分 子氫鍵等作用，使HPAM長鏈分子內或分子間的作用力降低，從而使溶液的粘 度減小。聚丙烯酰胺體係中原油的生物降解作用研究，在Na+作用下，HPAM溶液的相對粘度隨濃度增大呈現指數增長，兩條 曲線擬合R2都在4個9以上。
2. 4.2不同濃度的HPAM相對粘度和原油回收率的關係
在10隻潔淨的錐形瓶中分別加入100ml的100,200,300,400,500,600, 700，800，900，1000mg-L-1的HPAM溶液，在另一隻錐形瓶中加入100ml蒸餾
10-
0
%/#谘回思曬
o o o o o
9 8 7 6 5
200400600
HPAM濃度C/g ‘
800
1000
1-40
30
0
水作為對照，測定溶液的相對粘度，然後在各錐形瓶中加入原油40mg,振湯乳 化後將錐形瓶中的原油全部萃取計算原油回收率。測定結果如圖：
圖2-11不同濃度HPAM溶液中原油的回收率 Fig.2-11 The recovery rate of oil in HPAM solution
隨著聚丙烯酰胺濃度增大，溶液的相對粘度呈指數增長（指數擬合 R2=0.9997)，而原油的回收率則逐漸降低，相對於HPAM濃度具有一定的線性相 關性（線性擬合R2=0.9803)。
2.4.3不同濃度NaCl作用下HPAM的相對粘度及對原油回收率的影口向
在6個250mL錐形瓶中各加入200mg.L-1的HPAM溶液100mL，分別加入 NaCl使溶液中NaCl濃度為0, 2, 4, 6, 8, 10g-L-1，測定溶液的相對粘度，然
29
後加入原油40mg，測定原油回收率。另在6個250mL錐形瓶中加入100mL的 NaCl溶液，濃度分別為為0, 2, 4, 6, 8, lOg.L-1，加入原油40mg測定回收率。
-110
-100
%/#谘回思曬
50
60
測的結果如圖：
NaCl濃度C/g*L-1
圖2-12不同濃度NaCl下HPAM相對粘度及原油回收率變化 Fig.2-12 The recovery rate of oil in HPAM solution with different concentration of NaCl
%/#姿回
100.
在加入NaCl後，HPAM溶液的相對粘度迅速降低，隨著NaCl濃度的繼續 增大，相對粘度變化則趨於緩慢，在NaCl濃度為6g • L-1溶液相對於蒸餾水的 相對粘度僅為1.46，原油回收率到達95°%以上。
50
0246810
NaCl濃度C/g.L-1
圖2-13 NaCl的存在對原油回收率的影響 Fig.2-13 The recovery rate of oil in NaCl solution 在單純NaCl作用下，溶液與水溶液基本沒有區別，對原油回收率影響不大。
30
2.4.4pH對HPAM的相對粘度及原油回收率的影響
在7隻250ml的錐形瓶中各加入100mL濃度為200mg • L-1的HPAM溶液，
另一隻錐形瓶中加入100mL蒸餾水作為空白，用稀鹽酸和NaOH溶液調節前7 隻錐形瓶中溶液pH為2,4,6，7,8，10，12後測定相對粘度，然後分別加入 原油40mg,振蕩乳化後，測定原油回收率。
「100
6-
"
-90
I _
4 2
050
24681012
pH
nr % ^ ▲
%/#每回思M o o
8 7
圖2-14 pH對相對粘度及原油回收率的影響 Fig 2-14 The recovery rate of oil and relative viscosity of HPAM under different pH
水解引入的陰離子基團間的靜電排斥作用使聚合物鏈更加擴張，因此，隨 HPAM水解程度的增加，HPAM溶液粘度會持續增加[67]。200mg • L-1的HPAM 溶液的初始pH約為7。隨著pH的升高或降低溶液的相對粘度都會減小，原油 回收率則相應提高。pH升高會促進HPAM的水解，降低pH則抑製HPAM的溶 解性，在調節pH的過程中隨著Na +或Cl-的加入，HPAM的粘度也會隨之降低。
2. 4.5原油濃度
在5個錐形瓶中分別加入200mg • L-1的HPAM溶液100mL,然後加入原油 50, 100, 200, 300, 400mg,振蕩成乳狀液後，將原油全部萃取，相對於空白
計算原油回收率。
31
圖2-15不同濃度原油的回收率
Fig.2-15 The recovery rate of oil under different concentration of oil
溶液中存在溶解態和乳化狀的原油，由圖可已看出，隨著原油濃度的增大， 原油回收率有所下降，但下降幅度較小。
2.4.6滅菌及搖床振蕩對HPAM溶液相對粘度的影響
在高壓滅菌條件下，或在搖床生物培養機械振蕩作用下，聚丙烯酰胺體係中原油的生物降解作用研究，HPAM相對粘度會 有變化，在實驗過程對其變化進行了測定。在500ml的錐形瓶中加入200mg *L-1 的聚丙烯酰胺溶液200mL，封住瓶口，在121°C的滅菌鍋中滅菌20min。用澱粉 碘化鎘法測定滅菌前後溶液濃度。將錐形瓶放入搖床中轉速為120r* min-1振蕩， 測定其粘度變化。
Time/d
圖2-15 HPAM溶液相對粘度變化 Fig.2-15 The relative viscosity of HPAM 32
在滅菌前後測得溶液的濃度為197.4mg.L_1和202.4mg-1，溶液濃度基本不變，
而相對粘度則在滅菌後大幅降低，通過7天的振蕩，溶液相對粘度略微降低但變 化不大，相對粘度在2.1以上。HPAM溶液經滅菌，或溶液中添加有無機鹽後， 溶液粘度會顯著下降，原油與HPAM形成的乳狀液經石油醚萃取後回收率也較
高。
2. 5本章小結
本章對HPAM的部分性質進行了測定，比較了幾種常用的HPAM濃度測定 方法的適用性，並探討了部分因素對HPAM溶液相對粘度的影響，及對HPAM 與原油乳狀液中原油萃取的回收率變化，得到如下結論：
(1)對本論文所用到的聚丙烯酰胺的分子量進行了測量。計算得到聚丙烯 酰胺濃度的粘均分子摩爾質量M=9.184x106。
(2 )澱粉碘化鎘法能夠更好的適用於測定複雜水質中的HPAM濃度。
(3)HPAM水溶液相對粘度相對於其濃度呈指數增長，在單一鹽效應作用 下，仍保持指數增長模式。
(4)在HPAM與原油形成的乳狀液中，當通過調節pH、投加無機鹽、滅 菌、機械剪切等手段使HPAM溶液粘度降低時，原油回收率則相應提高。
33
3.原油的生物降解
3.1前言
油田汙水組成複雜，依據油田的生產、環境因素等可以進行回注或外排。回 注到地層和外排至環境中都需要將水體中的原油含量、懸浮物質等各項指標進行 嚴格控製，不能對地層係統或者生態環境造成傷害。而由於油田生產或者事故等 原因造成的水體汙染，也需要對其進行修複。本論文中主要討論用微生物對含油 汙水進行生化處理的室內研究。
在對含油汙水進行生化處理時需要合適的菌株及環境條件。在油田汙水中生 長有大量的物種豐富的微生物，通過一定的手段可以篩選出對原油具有較高降解 效果的菌株。微生物對原油進行降解時，pH、溫度、氧濃度等環境條件對降解 效果產生一定的影響，而聚合物驅汙水中存在的聚丙烯酰胺，對原油的狀態及溶 液性質產生影響，從而也會對微生物生長代謝原油產生影響。為了對油田汙水進 行有效地生化處理，實驗室前期篩選得到幾株降解原油的細菌，實驗過程中對保 存的菌種進行了活化，比較了其對原油的降解能力。本章的主要內容是從勝利油 田汙水中篩選得到能降解高濃度原油的細菌，對其進行了生理生化鑒定，並考察 了在HPAM存在條件下細菌降解原油的影響。
3.2材料和方法
3.2.1實驗材料和試劑 3.2.1.1實驗儀器
日本島津
上海山連實驗設備有限公司
DHG-9053電熱恒溫鼓風幹燥箱
UV-2450紫外分光光度計
江蘇金壇中大儀器廠
SHA-C水浴恒溫振蕩器
生產廠家
上海申安醫療器械廠
上海亞榮生化儀器廠
RE-52AA旋轉蒸發器
LDZX-50FAS立式電熱壓力蒸汽滅菌器
78-1磁力加熱攪拌器 SHP-150生化培養箱 pH計
YT-CJ-IND潔淨工作台金壇市雙捷實驗儀器廠 上海山連 HANNA 北京亞泰科隆
3.2.1.2實驗試劑
試劑生產廠家純度規格
_4)2S〇4天津市迪博化工試劑有限公司AR500 g
MgS〇4.7H2〇天津市巴斯夫化工有限公司AR500 g
KH2PO4天津市天大化工實驗廠AR500 g
K2HPO4.3H2O天津市博迪化工有限公司AR500 g
無水氯化鈣天津市科密毆化學試劑有限公司AR500 g
MnS〇4*H2〇天津市瑞金特化學品有限公司AR500 g
ZnS〇4*7H2〇天津市天大化工實驗廠AR500 g
FeS〇4*7H2〇天津市耀華化學試劑有限公司AR500 g
無水硫酸鈉天津市北方天醫化學試劑廠AR500g
石油醚30-60°C天津市博迪化工有限公司AR500 mL
NaCl天津市巴斯夫化工有限公司AR500 g
瓊脂北京雙旋微生物培養基製品廠AR1 Kg
3.2.2菌種的比較與篩選 3.2.2.1原有菌株的活化與培養
實驗室保藏菌株PM，B-1，D3-2對原油具有一定的降解效果，通過分別活 化，比較其降解原油的能力。
35
富集培養基：牛肉膏3 g.L-1，蛋白腖10 g.L-1，NaCl 5 g.L-1，（瓊脂）pH=7
微量元素：ZnS〇4-7H2〇 0.3 g-L—1，FeS〇4-7H2〇 0.5 g-L—1，CaCb 0.2 g-L—1， MnS〇4-H2〇 0.06 g-L'1。
無機鹽培養基：
(1) PM: HPAM 0 3 g-L'1，NaN〇3 0 3 g-L'1，MgS〇4 0 3 g-L'1，KH2PO4 0 5 g-L'1， K2HPO4 0.5 g-L'1，原油 0.2 g-L'1，微量元素 10mL/L，pH=7
(2) 3.1： NaCl 5 g-L'1，MgS〇4 0.5g-L'1，K2HPO4 3.0g-L'1，NaH2P〇4 3g-L'1， CaCb Q^g-L'1，原油 Ig-L'1，pH 7-7.5
(3) D3'2： NaCl 2 g-L'1，MgS〇4'7H2〇 0.7g-L'1，KH2PO4 3.0g-L'1，Na2HP〇4 Ug-L'1，CaCl2 0.1g-L'1，酵母粉 ^心1，原油，pH 7
3.2.3篩選菌株
3.2.3.1菌種來源
油田環境中生存有大量微生物，部分以原油作為碳源生存，菌種篩選自勝利 油田汙水。
3.2.3.2選擇培養基
NaCl 2 g-L'1，MgSO4-7H2O 0.7g-L'1，KH2PO4 3.0g-L'1，Na2HPO4 1.5g-L'1， CaCb 0.1g-L'1，酵母粉 1g-L'1，石蠟，pH〜7
(1)馴化：取油田汙水接種到裝有富集培養基的錐形瓶中，放入搖床培養2天 後，轉接到選擇培養基中，放入搖床培養3天，溫度30°C、轉速120r* min'1， 設定選擇性培養基中石蠟濃度依次降低，原油濃度逐漸升高。最後得到馴化成熟 後的菌液。
(2)分離純化：從馴化成熟的選擇性培養基中抽取菌液，多次轉接後，進行塗 布及劃線分離。取菌液在固體基礎培養基平板上塗布分離，得到單個菌落，挑取 不同的單個菌落，分別接種於液體選擇培養基中進行馴化培養，反複塗布分離， 得到純化的菌落。將純化後的菌落進行轉接，通過劃線培養，多次轉接之後，用 顯微鏡進行檢測，以保證充分分離純化，沒有混合雜菌，菌種的篩選完成。
(3)菌種保藏：將分離得到的菌種轉接到斜麵培養基上，放入生化培養箱，培 養約2d，觀察菌落生長，然後將培養基試管包好存入4C冰箱，斜麵培養基能進
36
行短期保存。長期保存則將甘油管和甘油分別滅菌後，在甘油管中加入適量的甘 油，挑取菌落懸浮於甘油中，將甘油管冷藏於-80°C的超低溫冰櫃中。
3.2.4細菌的生理生化鑒定
細菌的生化鑒定主要依照《常見細菌係統鑒定手冊》[67]、《簡明第八版伯傑 細菌鑒定手冊》[68]以及《微生物學實驗》[69]進行，主要對細菌的基本性質及形 態進行初步的鑒定。本次實驗主要進行了以下生化鑒定包括：V-P、甲基紅、接 觸酶和革蘭氏染色實驗等。
(1)革蘭氏染色：挑取一環生長成熟的菌體，將其均勻塗在、潔淨的淨的玻 片上的固定位置，滴加一滴無菌水將菌體稀釋分散開然後風幹固定。然後滴加結 晶紫混合液染1-2 min後，用蒸餾水洗去。接著滴加碘液，lmin之後用蒸餾水洗 去，再吸幹水分。用95%乙醇溶液進行脫色，蒸餾水洗至無色之後滴加沙黃複染 液進行染色2min，使用蒸餾水衝洗後風幹固定。完畢之後在油鏡下觀察細胞的 顏色。深紫色為革蘭氏陽性細菌，紅色為革蘭氏陰性細菌。
(2)接觸酶實驗
將細菌接種到基礎培養基平板上培養24h，使用接種環挑取適量菌體塗到已 滴加有過氧化氫溶液（3%)的載玻片上，如果有氣泡產生則為陽性，沒有產生 氣泡為陰性。
(3)甲基紅實驗
培養基配方：蛋白腖：5g/L;葡萄糖：5g/L; K2HPO4: 5g/L; pH=7.0-7.2。
將培養基分裝於小試管中滅菌；配製甲基紅試劑。將篩選的菌種，接種到試管中， 放置到30C的生化培養箱中培養2、6d;將試管取出，在菌液中滴加甲基紅進行 顯色反應，菌液顯紅色則為陽性，顯黃色則為陰性。
(4)V-P實驗
V-P培養基配方與甲基紅試驗中使用的相同，滅菌及接種方式也相同，預先 配製氫氧化鈉溶液（40%)和肌酸溶液。接菌之後，30°C生化培養箱中培養2天 和6天，取培養的菌液與氫氧化鈉按體積比1:1混合均勻，再加幾滴肌酸溶液， 10分鍾（有時需放置較長時間）後如過菌液顯現紅色，則為陽性反應。
37
生長繁殖是細菌的重要生命活動，而細菌在環境中生長繁殖也是有生命周期 的，生長曲線的測定就是為了反映細菌生長繁殖的過程。在細菌生長繁殖的過程 中，聚丙烯酰胺體係中原油的生物降解作用研究，生長速率會有變化，通常根據生長速率的不同將其生長曲線分為四個時期， 包括：延滯期、對數期、穩定期和衰亡期。當細菌接種到培養基中後需要適應環 境之後開始繁殖，這段適應時間極為延滯期，之後細菌生長進入對數期，細菌數 量呈對數增長，當細菌數量達到環境條件的極限時，在細菌大量繁殖的同時也會 有部分細菌死亡，細菌總量趨於穩定，穩定期之後營養物質逐漸消耗完，細菌數 量逐漸減少進入衰亡期。
實驗中，將細菌接種到培養基中之後，隨著細菌的大量繁殖，培養基會變得 越來越渾濁，而通過測定溶液的濁度可以反映細菌菌體的濃度。本實驗中分別將 篩選的細菌單獨和全混合菌接種到富集培養基中，以不接菌的培養基為空白對 照，在可見光分光廣度計600nm波長下測定培養接的濁度變化，連續測定14個 小時，然後繪製濁度OD對時間的曲線，即得到細菌的生長曲線。
3.2.6優勢菌株的篩選及降解條件的優化
菌株組合篩選：將篩選得到的細菌接種到選擇培養基，進行組合培養，按表 3-2的接種量進行，總接種量為3%，在30°C的恒溫水浴振蕩器中培養5天之後 測定原油降解率。
3.2.6.1 pH值對細菌降解原油的影響
在選擇培養基中加入NaCl濃度為2 g/L，原油質量濃度為3 g /L，分別調節 培養基的pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、和9.0，接種量3%。在恒溫搖床上培養 5d測定原油降解率，培養溫度為30°C，轉速120 r/m in 3.2.6.2NaCl質量濃度對細菌降解原油的影響
培養基中原油質量濃度為3 g/L，NaCl的質量濃度分別為0、1、2、3、4、
5、10和15 g/L。培養溫度30C，搖床轉速120 r/min，培養5d，一不接菌的為 空白，測定原油降解率。
3.2.6.3不同溫度下細菌對原油的降解效果
培養基NaCl濃度為2g /L，原油質量濃度為3g /L，設置培養溫度分別為4、
38
18、25、30、35和50°C，120 r/m in的條件下載搖床中培養5 d,相對室溫下不
接菌空白，測定原油降解率。
3.3結果與討論
3.3.1已有菌株對原油的降解能力
PM係列：當原油濃度為0.1g.L-1時，降解率達到70%以上，但隨著原油濃 度增大降解率則隨之降低。當原油濃度為3g*L-1時，PM，B-1，D3-2對原油的降 解率都在20%以下
圖3-1原油濃度對原油降解率影響 Fig.3-1Degradation rate under different crude oil concentration
Bacteriums
圖3-2三株細菌對原油的降解能力 Fig.3-2 Degradation rate of different bacteriums
39
因此重新進行了細菌篩選，已期得到較好的降解效果。 3.3.2菌株篩選結果
經過篩選分離得到三株好氧細菌。暫將其命名為W-1，W-2, Y-1。菌株革 蘭氏染色照片為
W-1W-2Y-1
圖3-3革蘭氏染色照片 Fig.3-3 Photos of Gram stain
表3-1為三株細菌的形態及部分生理生化鑒定結果
表3-1細菌的生理生化特征 Table 3-1 The physiological and biochemical property
測試項目W-1W-2Y-1
細菌形狀杆菌短杆杆菌
菌落顏色白色乳白黃色
透明度不透明不透明半透明
革蘭氏染色+++
接觸酶+++
甲基紅+--
V-P測定+--
40
圖3-4細菌的生長曲線 Fig.3-4 Bacterial growth curve
將三株細菌W-1, W-2和Y-1分別以及三株細菌等量混合以3%的比例接入 到富集培養基中，以不接菌的培養基溶液為空白對照，測得的OD-時間曲線。， 從3-4圖中可以看出，在0-3h內處於延滯期，三株單菌及混合菌生長較為緩慢。 之後細菌OD值迅速增加，細菌大量繁殖進入對數增長期。經過5個小時的對數 增長之後，菌液OD增長幅度明顯放緩，三株細菌進入穩定期的時間基本形同。 在8-13h之間，OD值略微增加。由於菌體死亡之後，菌液仍然渾濁不會變清， 濁度法在判斷細菌生長的衰亡期具有一定困難。其中菌株W-1與W-2的生長較 快，菌液濁度較大，而Y-1則相對濁度較小，可能因為Y-1菌落為半透明黃色， 其菌液吸光度會較另兩株菌小。
3.3.4細菌對原油的降解能力
在實驗過程中選育優勢組合菌株，進行降解實驗。在8隻250mL的錐形平 中分別加入選惡性培養基100mL，滅菌後後按如下表比例進行接種，接種總量 為3% (體積比）。在120rmin-1，30°C的搖床中培養5天，以不接菌的錐形瓶為 對照，測定原油降解率。
41
Table 3-2 Inoculum size of combined cultivation
序號對照1234567
W-103001.51.501
W-200301.501.51
Y-1000301.51.51
(％)嫌遨盤
菌組
圖3-5菌株組合降解效果 Fig.3-5 The degradation effects of composite strains
單株細菌的降解能力不到20%，除了第6組，組合菌的降解能力均有所提高， 而仍然以三株細菌組合的菌組對原油具有較好的降解能力。後續實驗中選擇W-1， W-2，Y-1的混合菌液作為菌種進行原油降解實驗。
3.3.5部分營養的改變對細菌生長及原油降解的影響
實驗過程中比較了部分營養元素的變化對細菌生長及原油降解的影響。其中 比較了酵母粉與NaN〇3共同作為N源或作為唯一 N源的影響。在細菌篩選過程 中，添加的少量石蠟有助於細菌的生長，因此比較了在是否添加石蠟的情況下， 細菌對原油的降解效果。另選擇(NH4)2HP〇4與NH4H2PO4作為N源和P源，t匕 較其相對於其它培養基是否具有優勢。
42
買驗分組如下表，表中宮養物質單位為g/L, 6隻250mL錐形瓶中按表添加 培養100mL,滅菌後接菌量為5%,空白對照不接菌，在120rmin-1，30°C的搖
床中培養5天，測定菌濃及原油降解率。
表3-3培養基配方
Table 3-3 Medium
123456(空白）
NaCl222222
MgS〇4 • 7H2〇0.70.70.70.70.70.7
KH2PO43.03.03.03.0-3.0
N2HPO41.51.51.51.5-1.5
CaCl20.10.10.10.10.10.1
原油333333
酵母粉0.50.25-0.50.50.5
NaNO3-0.350.5---
_4)2HP〇4----3-
NH4H2PO4----3-
液體石蠟---0.2--
ndo60_l
4 18 5 2 2 11
%/(D10y u 〇 !lep(oJ 69Q
D菌濃 D降解率
圖3-6不同培養基中菌濃及原油降解率 Fig.3-6 The degradation rate of oil and bacterial concentration in different mediums
43
通過1，2, 3組的比較可以發現，酵母粉作為唯一 N源時，細菌生長量及
對原油的降解效果，高於以藤 N源，可能是因為酵母粉作) 促進細菌生長的部分氨基酸。 培養基中菌濃有所提高，但對 但同時作為C源與原油產生j 菌濃和原油降解率均為最低。
因此後續實驗中選擇培養 KH2PO4 3.0g-L-1, Na2HP〇4 1.
3.3.6組合菌株在不同環境條
^母粉、NaNO3混合N源，或者以NaNO3作為唯一 ^有機N源更容易被細菌利用，而且酵母粉中含有 通過1，4組的比較，發現添加少量石蠟的情況下， 原油的降解效果則降低了，石蠟促進了細菌的生長， 筆爭。（NH4)2HP〇4與NH4H2PO4作為N源和P源，
聲基配方為：NaCl 2 g-L-1，MgS〇4-7H2〇 0.7g-L-1， 5g-L-1，CaCl2 0.1g.L-1，酵母粉 1g-L-1，pH 7。
^件下對原油的降解能力測試
'原油降解效果
3.3.6.1不同pH條件下細菌對
0/0/CDley uolle!DeJ69cl
5 0 2 2
—1 5
高或過低都影響降解率，在pH=7.0時細菌對原油的
6789
pH
圖
Fig.3-7 ]
3.3.6.2不同鹽度條件下細菌對 從圖3-8可以看到隨著鹽
3-7 pH對原油降解率的影響 Degradation rate under different pH
t原油降解能力
^度的增大該菌組對原油的降解率先增大後減小，聚丙烯酰胺體係中原油的生物降解作用研究，不 該菌株組合對高鹽度具有一定的耐受性，而當NaCl 為3g.L-1時降解效果最佳。
44
NaCl/g-L-1
圖3-8鹽度對原油降解率影響 Fig.3-8 Degradation rate under different salt content(NaCl)
3.3.6.3不同溫度下菌組對原油降解效果
圖中的數據顯示細菌在30-35°C時生長最好，降解效果效果最佳。當溫度很 低時，細菌對原油幾乎沒有降解效果。溫度上升，使細菌的酶活性加強，細菌的 降解能力相應增強，而當溫度繼續上升時，酶活性則下降，降解能力降低。
圖3-9溫度對原油降解率影響
Fig.3-9 Degradation rate under different cultivation temperature
45
3.3.7原油降解效果 3.3.7.1優化條件下細菌對原油的降解效果
通過對營養元素的選擇，及環境條件的優化。選擇在優化的條件下進行後續 的實驗，培養基配方為：NaCl 3g-L-1，MgS〇4-7H2〇 0.7g-L-1，KH2PO4 3.0g-L-1， Na2HP〇4 1.5g-L-1，CaCb 0.1g-L-1，酵母粉 1g-L-1，pH 7。培養條件為：溫度 35 。。，pH〜7。
在此條件下培養5天測定了原油降解率為31.4%。這個降解效果，相對於其 它降解石油烴的高效菌株來說，降解效率仍然偏低。
3.3.7.2不同聚丙烯酰胺濃度下細菌對原油的降解作用
預先配置1000mg*L-1的HPAM溶液備用。在250mL的錐形瓶中加入含聚丙 烯酰胺的培養基100mL，使培養基中的聚丙烯酰胺濃度分別為：0, 200, 400, 600, 800, 1000mg.L-1，滅菌後進行接種培養，將混合菌液按總量5%的比例接 入培養基中，另6隻錐形瓶加入同樣的培養基滅菌後作為對照，在35°C，120rmin-1 的搖床上培養一周，測定原油降解率。得到如下結果：
05050505 4 3 3 2 2 1 1
%/0rocc:uolropeJ60Q
02004006008001000
Concentration of HPAM/mg •L-1
圖3-10不同濃度HPAM條件下原油降解率 Fig.3-10 The degradation rate of oil in HPAM solution with different concentration 加入HPAM後，原油降解率在30%-40%，隨著HPAM濃度增加，細菌對原
油的降解率略有增加。經滅菌之後，溶液的粘度降低很多，而且因為培養基中大
46
量無機鹽離子的存在，可以認為原油的回收率很高，受HPAM濃度影響不大。
在500mL的錐形瓶中加入選擇培養基200mL，使HPAM濃度分別為0，0, 500mg-L-1，分別編號為：空白，1，2。空白不接菌，1、2號接菌，在35°C，120rmin-1
的搖床上培養一周，實驗過程中比較細菌生長。並測定最後的降解率。
在實驗過程中發現，所篩選的得到的細菌還具有絮凝效果。如下圖中照片： 搖床培養7天後靜置一段時間，液麵浮油都絮凝沉降至瓶底，且溶液變得相對澄 清，而空白對照瓶原油大多浮在液麵或懸浮於溶液中。含有500mg.L-1的HPAM 的錐形瓶中，絮凝沉降得更加徹底。
空白對照12
圖3-11原油降解效果 Fig.3-11 Crude oil degradation effects
實驗過程中，每天觀察溶液乳化狀況，2號錐形瓶，經過第一天的培養後原 油與溶液混合較為均勻，沒有大塊浮油，比1號瓶提前。
圖3-12 HPAM對細菌生長的影響
Fig.3-12 The effect of HPAM on growth of bacteria
47
測定了第2到第7天的菌濃得到結果如下：
在初期，菌濃幾乎相同，在第2天和第三天，培養基中菌濃都維持在108-109 數量級。從第四天溶液中菌濃開始下降，而到第一周時，含HPAM的溶液中， 細菌則維持著較高菌濃接近108,比不添加HPAM的培養基中高出一個數量左右， 這可能是因為一方麵HPAM的存在使溶液中溶解態和懸浮狀的的原油增多，增 大了油水界麵麵積，利於原油被細菌作為營養利用，另一方麵HPAM能提供一 小部分的N源。
含500ng*L-1的培養基經滅菌，而且溶液中含有大量無機鹽，溶液的相對年 度降低，原油回收率在94%以上。1, 2號錐形瓶測得原油降解率分別為30.71% 和39.12%。添加HPAM後原油降解率略有提高。
3.4本章小結
本章主要比較並篩選出降解原油的優勢細菌，並對其降解能力進行了優化與 測定：
(1)篩選出3株對原油具有一定降解效果的細菌並定性考察了 3株細菌的 生理生化性質。
(2)通過構建優勢混合菌，並優化出細菌降解原油的環境條件為：pH =7, 最佳鹽度為NaCl=3g.L-1，溫度35°C。
(3)初步探索了添加HPAM對細菌生長及對原油降解效果的影響。添加 HPAM後，對細菌具有一定促進能力，原油降解率略有提高。
48
4.HPAM存在條件下細菌對原油的降解作用
4.1前言
前期篩選的到三株對原油具有降解和絮凝效果的細菌，在實驗過程中主要使 用錐形瓶在恒溫水浴振蕩器上進行搖瓶實驗，發酵液體積較小，溶解氧等因素不 易控製。本章中通過10L的發酵罐，進行擴大培養，通過控製攪拌和曝氣等手段 精確控製和監測發酵過程，模擬在HPAM環境下細菌對原油的降解作用，並對 發酵過程進行全程監測。對發酵過程中的細菌生長過程、溶液粘度、表麵張力、 HPAM濃度、原油組分等參進行測定。通過GC-MS對發酵過程中原油烴組分的 變化進行檢測。
4.2材料和方法
4.2.1實驗材料和試劑
4.2.1.1實驗儀器
上海申安醫療器械廠 上海保興
江蘇金壇中大儀器廠 日本島津 曰本島津
北京亞泰科隆實驗科技開發中心 金壇市雙捷實驗儀器廠 江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠 上海山連實驗設備有限公司 HANNA Instruments 日本Nikon 上海衡平儀器儀表廠
LDZX-50FAS立式電熱壓力蒸汽滅菌器
發酵罐
SHA-C水浴恒溫振蕩器 UV-2450紫外分光光度計 BL-2200H電子天平 YT-CJ-1ND型潔淨工作台
78-1磁力加熱攪拌器 SZ-1快速混勻儀 DHG-9053電熱恒溫鼓風幹燥箱 pH計
YS100顯微鏡 BZY-2表麵張力儀
儀器名稱生產廠家
JZ200A界麵張力儀
血球計數板 精密增力電動攪拌器 氣相色譜儀 氣相色譜/質譜聯用儀承德市精密試驗機有限公司
常州國華電器有限公司 島津 GC-2010 島津 GC-2010
4.2.1.2實驗試劑
試劑生產廠家純度規格
NaCl天津市博迪化工有限公司AR250g
NaN〇3天津市博迪化工有限公司AR250g
石油醚國藥化學試劑有限公司AR250g
可溶性澱粉 天津市天泰精細化工有限公司AR1 kg
碘化鎘上海天蓮精細化工有限公司AR500 g
溴水國藥化學試劑有限公司AR500 g
次氯酸鈉天津廣成化學試劑有限公司AR500 g
甲酸鈉天津市科密毆化學試劑有限公司AR500g
冰醋酸天津廣成化學試劑有限公司AR500ml
正己烷天津市巴斯夫化工有限公司AR500ml
正己烷天津市巴斯夫化工有限公司色譜純500g
內標西格瑪奧德裏奇（上海）貿易有限公司色譜純-
4.3發酵罐發酵試驗
4.3.1培養基及發酵條件 4.3.1.1培養基
營養物質g/L5L 量/g
NaCl315
MgS〇4-7H2〇0.73.5
KH2PO43.015
Na2HPO41.54.5
無水CaCb0.10.5
酵母粉110
原油325.47
50
HPAM〇.525
微量兀素液，1mL/L，121 °C滅菌20 min。
實驗過程中發酵培養基為5L，為防止原油大量粘附罐壁或攪拌葉輪上，保 證可有效利用的原油的量，在發酵罐中加大了原油的量。
4.3.1.2發酵條件
發酵條件參數
溫度35。。
鹽度NaCl 3g/L
pH7.0
曝氣0.1-0.3 L/min
轉速100-200 rpm
4.3.2采樣與數據測定 4.3.2.1 采樣
101mL50mL5mL10mL100mL
2
351505
49150510100
5241505
630150510100
7351505
848150510100
972150510100
1096150510100
11120150510100
12144150510100
13168150510100
14停
PH電極自動測定記錄 溶解氧探頭自動測定記錄
采樣 時間 菌濃表麵 HPAM 溶液石油烴溶解氧pH 序號（小時）張力 濃度 粘度
每次米樣lOOmL，抽取1mL用於測定囷濃。然後將溶液用正己燒卒取，有 機相用於測定原油烴組分，水相經過濾後，用於測定HPAM濃度、溶液表麵張 力、溶液粘度等指標。發酵過程中的溶解氧及pH變化由探頭直接測定。
4.3.2.2菌濃測定
為保證數據的準確度，采用平板法和血球計數板法兩種方法測定細菌濃度:
(1)MPN 法[70]:
在西林瓶中準確注入9mL的蒸餾水，滅菌之後備用。聚丙烯酰胺體係中原油的生物降解作用研究，用無菌注射器將1mL 的菌液，注入到注如9mL蒸餾水的西林瓶中，充分搖勻，如此菌液中的細菌濃
51
度就被稀釋了 10倍。再從此稀釋液中抽取1mL菌液，注入到下一個西林瓶中。 按照這樣的步驟，依次逐級稀釋，就會得到稀釋了 10,、102、103、104…各個稀 釋倍數的菌液。用無菌注射器分別取0.1 mL104到107四個稀釋度的菌液於富集 培養基的平板上，使用塗布棒均勻塗布。每個濃度梯度塗三個平板作為平行樣。 將平板置於35°C的生化培養箱中培養3d之後，對平板上的菌落進行計數。計算 出原始菌液中的菌濃：
總活菌數/mL =符合條件的稀釋度3個平板上的菌落平均數X稀釋倍數X10
(2)血球計數板法[71]:
血球計數板是一塊具有精密刻痕的載玻片，左圖中的井字形區域放大後即為 右圖結構。計數區域是一個邊長為1mm的大方格，在計數室上方平放蓋玻片後， 載玻片距離蓋玻片0.1mm，因此可以計算出計數室的容液容積為0.1mL。在25 X 16型的計數板中，中央計數區域的大方格由25個中方格構成，每都一個中方 格由16個小方格構成。當菌液充滿計數室時，一般選取五個中格，數得總菌數 之後，求得中方格中菌數的平均值。用此平均值乘以25，即計算出了 25個中格 總的細菌數目，之後再計算出1mL菌液中的總菌數。
ll!lilllilllllllll]|
_ , ■ : : i , ^^1
圖4-1血球計數板構造 Fig. 4-1 The structure of blood counting chamber
本次實驗中使用的計數板規格為25X16。由於原始菌液中菌濃很高，直接
52
計數無法數清菌體數，采用逐級稀釋法對菌液進行稀釋。計數完畢後。依下列公 式計算菌濃：
細菌個數/1mL=5個中方格菌體總數/80 X 400 X 400 X 10000 X稀釋倍數
4.3.2.3.表麵張力的測定
每次取樣後，對原油進行萃取後，水溶液中含油量很低，經濾紙過濾吸附過 程能保證液麵沒有油花，對儀器測定不會產生幹擾。經處理過的溶液，取約30mL 密封保存於4°C的冰箱中。為保證儀器測定的準確性，實驗最後統一測定溶液的 表麵張力。采用吊環法和吊片法兩種方法測定表麵張力。
4.3.2.4.HPAM濃度的測定
取5mL處理後的溶液密封保存於4C的冰箱中，實驗最後用澱粉碘化鎘法 統一測定溶液中HPAM的濃度。
4.3.2.5溶液粘度測定
取10ml處理後的溶液密封保存於4°C的冰箱中，用烏氏粘度計(0.5-0.6mm)， 在30C條件下測定溶液的相對粘度。
4.3.2.6原油烴組分分析[72]
(1)實驗過程中，每天采出的水樣，經正己烷萃取後，將原油的正己烷溶液轉 入幹燥的小燒杯中，加入適量的無水硫酸鈉，去除含有的水分。然後再將溶液轉 入已經稱重的潔淨的小燒杯中，將燒杯放在通風廚中揮發正己烷，待揮發完畢後 稱重，計算原油質量。
(2)將稱重的原油樣品，完全溶解到色譜純正己烷中，定容到25mL。然後經 過柱層析分離得到脂肪烴組分和芳烴組分氮吹濃縮至進樣合適體積，加入內標。
(3)樣品分析條件：
組分正構烷烴芳烴
方法GC-FIDGC-MS
色譜柱30 m^0.32 mm^0.25 ^m30 m^0.32 mm^0.25 ^m
DB-5毛細管色譜柱DB-5 毛細管色譜柱
載氣氦氣，2.5 mL/min氦氣，1.0 mL/min
分析不分流進樣；進樣時間：1 mm。進不分流進樣；進樣口溫度：290 C;
條件樣口溫度：290 C;檢測器溫度：300檢測器溫度：300 C;程序升溫：90
53
°C;程序升溫：50 °C保持2 min，以°C保持1 min，以25 °C/min升到160 6 °C/min 的速度升到 300 °C，300 °C °C，以 8 °C/min 升到 290 °C，保持
保持16 min;進樣量：1卩L。15 min。
定性利用保留時間與標準比對判斷組分保留時間與特征離子結合進行定性
分析峰位置，結合原油正構烷烴分布規分析
律進行判斷
(4)原油烴組分的定量分析
采用內標法定量法計算各組分濃度，其中正構烷烴內標為C24D50,多環芳烴 內標為 Terphenyl-D14。
內標定量計算公式如下，計算得到c (pg/g):
RRF = AC0 'Wl0
A10 WC0 c = AC11
An.RRF.Ws
式中:
AC 0——標準中組分峰麵積；
A10——標準中內標峰麵積；
WC0標準中組分量；
Wj 0標準中添加內標量；
AC1 —樣品中組分峰麵積；
An——樣品中內標峰麵積；
Wn樣品中內標量；
Ws——樣品質量；
c——樣品中組分濃度（昭/g)。
54
4.4結果與討論 4.4.1發酵過程監測
每次采樣時，將攪拌轉速調到300rmin-1，將發酵液攪拌均勻，然後采樣到
滅過菌的潔淨錐形瓶中。每天的發酵液照片如下：
Id2d3d4d5d6d7d
•I感壘籲■靨麗憂
圖4-2 1-7d發酵液照片
Fig.4-2 Fermentation photos through 7 days
發酵液表層底層
圖4-3最終的發酵液照片 Fig.4-3 Fermentation photos
發酵罐中原油與培養基一起滅菌，冷卻之後，原油大多浮在液麵或者粘附到 罐壁和攪拌葉輪上。發酵開始後，如圖4-3中第一幅圖，原油少量進入水體，發 酵進行24h之後原油開始均勻的混入水體，之後液麵上基本沒有大塊浮油，形成 均勻的油水混合狀態。在發酵結束之後，將發酵液保存於燒杯中靜置24h後，大 量原油沉降到瓶底，發酵液上層變得較為清澈，液麵隻有很少的浮油存在。
4. 4.2細菌生長曲線
在接種5小時開始采樣，48小時之內采樣6次，之後每天采樣一次。塗布 梯度為10-5，10-6，10-7。血球計數板法計數梯度為10-1，10-2。計算出每1mL發 酵菌液中的細菌數，對菌數取對數值，得到如圖4-4的結果。
55
6
024487296120144168
Time/h
6
0
24487296120144168
Time/h
圖4-4細菌生長曲線 Fig.4-4 Bacteria growth curve
2d4d6d7d
圖4-5發酵過程菌落照片（10-7)
Fig.4-5 Colonies photos (10-7)
發酵初期，細菌快速生長，在24h時達到最大，細菌總濃度在109/mL以上, 之後菌濃開始下降，但仍在168h內保持在108/mL。在富集培養基中W-1細菌優
勢生長，但在含有選擇性培養基中，W-2是發酵過程的優勢菌株，W-1菌濃一直 低於W-2 —個數量級。Y-1細菌在24h內繁殖較快，之後與W-1都處在107/mL
的濃度。 圖4-5右圖顯示，通過CFU法和血球計數板法測得菌濃及其趨勢基本相符。 4.4.3表麵張力變化
發酵過程中，采得水樣，由於含有原油，對測定影響較大。經過萃取和過濾 後，原油基本被去除完全。實驗過程中為保證測定的準確性，同時使用吊環法和 吊片法對溶液的表麵行裏進行測定。將溶液保存後統一測定，會保證儀器測定的 相對穩定性。通過兩種方法測得結果如下圖：
56
吊片法
55-
50-
45-
吊環法
40
024487296120 144 168
Time/h
圖4-6發酵液表麵張力變化 Fig.4-6 Surface tension of bacterial broth
圖中-24h處顯示的數值為表麵張力儀測定的室溫下蒸餾水的表麵張力值。兩 種方法測定的表麵張力值變化趨勢基本一致，在發酵初期（0-9h)表麵張力有小 幅降低，隨後保持穩定到24h，在24-36h間又有小幅降低，而在後續的發酵過程 中表麵張力較為穩定並有略微降低。總體來說，在發酵過程中，溶液的表麵張力 在持續降低並趨於穩定，降低幅度不是很大。細菌產生的代謝產物可能是表麵張 力降低的原因，而HPAM的存在會一定限度的維持溶液表麵張力的穩定。
4. 4.4溶液粘度及HPAM濃度變化
Time/d
2.0
-2
▲
3.5-
3.0-
2.5-
-V 0 ' 1 ' 2 ' 3 ' 4 ' 5 ' 6 ' 7
Time/d
8
實驗過程中，測定了溶液的粘度變化及HPAM的濃度變化。測得結果如下:
圖4-7溶液相對粘度及HPAM濃度變化 Fig. 4-7 The relative viscosity and HPAM concentration of bacterial broth
57
通過上麵兩幅圖可以發現，在通過高壓滅菌後，溶液的相對粘度大幅降低， 由於發酵罐在位滅菌時間很長，相對於滅菌鍋滅菌，其粘度降低更多。在發酵過 程中，溶液的粘度略有降低，可能是由於葉輪攪拌的機械剪切作用所致；另外可 以發現HPAM濃度呈下降趨勢，但隻由500mg-L-1降到440mg-L-1，降低值也很
有限。
4. 4.5發酵曲線
在實驗過程中發酵罐監測的數據包括：發酵時間t/h,發酵溫度T/°C，發酵 液pH、，溶解氧DO/%,攪拌轉速ZS/rpm，通過對發酵時間作圖得到如下結果：
圖4-8發酵曲線 Fig.4-8 Fermento graph
發酵罐采用內部溫度探頭和外部冷卻循環水雙控控溫係統，溫度維持在 35C。在0-48h，攪拌轉速為100r.min-148-168h為200rmin-1。溶解氧由曝氣和轉
速控製，在0-24h內，溶解氧到達飽和後逐漸降低。自48h調整轉速為200rpm 後，溶解氧呈逐漸上升趨勢，在120h達到飽和。
58
Hd
△
6.6
024487296120144168
Time/h
nLLo6〇_l
8
圖4-9發酵液菌濃與pH值變化 Fig.4-9 The bacterial concentration and pH of bacterial broth 上圖是pH的變化趨勢，初始pH為6.68,在0-30h期間，pH逐漸降低，30-168h
則逐漸升高，pH在6.6-7.3之間。可以看出pH的變化趨勢與菌濃的變化趨勢是 相反的，在初期細菌大量繁殖，可能產生酸性代謝產物使pH降低，而隨著繼續 代謝，酸性物質開始逐漸減少，pH上升。在生理生化鑒定甲基紅實驗中，W-1 呈陽性，而W-2, Y-1都呈陰性，而W-2菌在發酵過程中是優勢菌，所以發酵液 pH總體趨勢升高也是合理的。
4. 4.6細菌降解原油組分分析
發酵開始之前，和連續7天采集水樣得到的原油樣品質量為：
時間/d0(空白） 1234567
質量/g0.35150.57360.41810.63390.47820.39300.53780.6590
4.4.6.1正構烷烴
5000500050
9
5
…uv〇iio,ooo)
uoUBPlmqy
n
.1
/m
me
-【11
s
cuolmXJ目 q<
SUBPUnqy
:
,,uV(3100.000)
圖4-10正構烷烴GC-FID色譜圖 Fig.4-10 The GC-FID chromatograms of nalkanes
61
30000¬25000¬320000¬) • 15000¬:
：10000- 1 5000-
0
空白
7d
卓 nil
圖4-11正構烷烴組分濃度變化 Fig.4-11 Component concentration of nalkanes
62
圖4-12原油各組分降解率（7天）
Fig.4-12 Biodegradation rate of nalkanes
圖4-10是測得的原油正構烷烴GC-FID色譜圖，聚丙烯酰胺體係中原油的生物降解作用研究，通過內標法轉換計算之後 得到圖4-11的正構烷烴的組分濃度圖。
從圖4-11可以看出，在實驗過程使用的三株細菌，對部分烷烴具有很好的 降解效果。通過比較圖4-11中第一天和第三天的組分變化圖可以發現，在發酵 初期（0-2d)，雖然細菌大量生長，但原油基本沒有發生降解。可能是因為細菌 在初期優先吸收培養基的酵母粉作為碳源。將第6天和第7天的原油組分與空白 驚醒比照，可以看出經細菌發酵處理之後，原油組分總豐度顯著降低。
根據原油組分變化，換算出了 7天內的原油降解率如圖4-12所示。細菌對 大部分正構烷烴的降解率達到60°%以上，正構烷烴中豐度較小的C13-C16以及 C36-C38均被最大限度的降解，頭尾的C13和C38的降解率均達到99°%。在初始點 取的空白原油樣中，C28-C32是原油組分中豐度最大的幾個組分，占到正構烷烴 總量的61%,除了 C30烷之外，細菌對其它4種組分的降解率約為80%。實驗中， 細菌對部分烷烴降解率很低或者沒有發生降解：C35、C32、C30、C27、C26、C24 和 C23。
4.4.6.2芳烴組分
63
8§punqv
d
IX
Time/min
4100.000.)
10.
3o§T3uncly
7d
''l(i.O ' ' 1^.0 ' ' 2(i.O ' ' y.d ' ' y.fli ' ' 3I0 ' ' 4^.0 ' 4^.0 ' ' 5(J.O ' ' 5^.0 ' 6(J6 ' ' 6^.0 '''
Time/min
圖4-13芳烴GC-MS色譜圖 Fig.4-13 GC-MS chromatograms of aromatic hydrocarbons
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Naphthalene 1 -Methyl-naphthalene 1 -Ethyl-naphthalene 1,6-Dimethyl-naphthalene Ethyl-methyl-naphthalene
1.3.7-Trimethyl-naphthalene
1.3.6.7-T etramethyl -naphthalene Dibenzothiophene
Fluorene
101 -Methyl-fluorene
11Methyl-fluorene
12C2-fluorene
13Phenanthrene
142-Methyl-phenanthrene
15Ethyl-phenanthrene
169-Ethyl-phenanthrene
171,9-Dimethyl-phenanthrene
18C3 -Phenanthrene
圖4-14芳烴組分濃度
19Trimethyl-phenanthrene
20C4-Phenanthrene
214-Methyl-dibenzothiophene
22Ethyl-dibenzothiophene
23Dimethyl-dibenzothiophene
24Trimethyl-dibenzothiophene
25Chrysene
263-Methyl-chrysene
27C2-Chrysene
Fig.4-14 Component concentration of aromatic hydrocarbons 圖4-13是芳烴組分的GC-MS色譜圖，通過計算繪製出芳烴組分的濃度，如 圖4-14所示。
所篩選的到的三株細菌對芳烴的降解模式類似於烷烴，在發酵初期0-3天內， 甚至到發酵第5天，細菌仍不能有效地利用芳烴使之發生降解，但在發酵後期對 部分芳烴組分降解效果顯著，除了4取代萘，萘的同係物均被完全降解（不排除 發酵過程中組分的自然揮發損失）。隨著芳烴環數的增多，降解難度增大，三甲
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基二苯並噻吩（Trimethyl-dibenzothiophene)以及Chrysene及其同係物幾乎沒有
發生降解，組分濃度在7天的發酵過程中一直保持穩定。
經過計算烷烴的總降解率約為70%，芳烴的總降解率約為80%。此降解率明 顯高於在使用搖瓶培養過程中，用紫外分光光度法測的原油降解率39%。一方麵 由於方法存在差異，另外發酵過程中，控製的環境條件更利於細菌的生長，大大 提高了對原油的降解效果。
4. 5本章小結
本章係統的考察了聚丙烯酰胺環境中細菌對原油的降解作用。主要獲得以下 結論：
(1)發酵過程初期，細菌增長迅速，在30h內增長到最大菌濃，之後菌濃維 持穩定並緩慢降低。隨著細菌的生長，發酵液表麵張力逐漸降低，原油乳化明顯。 而pH值得變化趨勢與菌濃變化趨勢相反。
(2)經滅菌過程，溶液粘度大幅降低，在之後的連續發酵過程中，發酵液的 相對粘度保持穩定並有小幅下降。聚丙烯酰胺的濃度略微減小由500mg_L-1降低 到440mg.L-1。聚丙烯酰胺的存在對原油乳化絮凝效果良好，發酵結束後，將發 酵液靜置，大部分原油發生絮凝沉降。
(3)三株細菌混合發酵，對原油具有顯著的降解效果，聚丙烯酰胺體係中原油的生物降解作用研究，部分烷烴芳烴被完全 降解。對正構烷烴總降解率為70%，對芳烴總降解率為80%。
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5結論
5.1結論
本論文主要以聚合物驅含油汙水作為研究對象，初步探索了聚丙烯酰胺存在 的環境中細菌對於原油的降解作用。實驗過程中考察了 HPAM濃度的測定方法， HPAM溶液中原油的回收率並從含油汙水中篩選了對原油具有一定降解效果的 菌株，利用發酵罐模擬了含聚汙水中細菌對於原油的降解行為。實驗所得主要結 論如下：
(1)實驗過程中使用的陰離子聚丙烯酰胺其相對分子量為M=9.184x106; 在澱粉碘化鎘法、濁度法、粘度法和導數紫外法四種測定聚丙烯酰胺濃度的方法 中，澱粉碘化鎘法較適用於汙水中HPAM濃度的測定。
(2)聚丙烯酰胺的相對粘度隨濃度增加呈指數增長，無機鹽增加、滅菌、 機械剪切會使聚丙烯酰胺的相對粘度降低，pH值的增高或降低也會使聚丙烯酰 胺的相對粘度降低。聚丙烯酰胺與原油形成的乳液中，利用石油醚對原油進行萃 取回收，溶液相對粘度越大，原油回收率越低。
(3)從勝利油田汙水中篩選得到三株對原油具有降解效果的細菌：W-1， W-2，Y-1。通過比較，三株細菌混合對原油具有較好的降解效果，通過對營養 元素的選擇，及環境條件的優化。培養基配方為：Naa3g.L-1，MgS〇4.7H2〇 0.7g-L-1，KH2PO4 3.0g-L-1，Na2HP〇4 1.5g-L-1，CaCb 0.1g.L-1，酵母粉 1g-L-1，pH 7。培養條件為：溫度35 °C，pH=7。培養5天混合菌株對原油的降解率為31.4%， 菌株對原油具有一定的絮凝能力，能將使大部分原油沉降。
(4)在培養基中添加聚丙烯酰胺後，在初期溶液中菌濃與不添加聚丙烯酰 胺基本一致，隨後增加，在第6天時比不添加HPAM高出一個數量級；而隨著 HPAM濃度的增加，細菌對原油的降解率略有增加。HPAM的存在對細菌生長具 有促進作用。
(5)在聚丙烯酰胺環境中，經發酵罐控製發酵，三株細菌對原油具有良好 的降解效果。細菌對原油組分中的大部分烷烴和芳烴都具有明顯降解效果，對烷 烴總體降解率為70%,對芳烴總體降解率為80%。聚丙烯酰胺的存在，原油發
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酵時乳化明顯，發酵結束後體係中原油發生了絮凝沉降。
5.2存在的問題及展望
由於受到實驗條件和實驗時間的限製，實驗存在不足，具體如下：
(1)論文對HPAM與原油的相互作用探索十分淺顯，聚丙烯酰胺體係中原油的生物降解作用研究，沒有對原油與聚丙烯 酰胺溶液的乳化與破乳機理進行研究。
(2)沒有對篩選的菌種進行鑒定分析，三株細菌對原油的降解效果並不太高。 細菌對於原油具有絮凝效果，欠缺對絮凝原因進行深入探索。
(3)HPAM對細菌生長影響及對降解原油的影響探索不夠。
(4)由於發酵罐運行限製，沒有對聚合物環境中細菌對原油的降解作用進行 長期考查，溶液中聚丙烯酰胺的變化欠缺研究。
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