蛋白質、核酸、葡萄糖、氨基酸等許多生物大分子的分離分析是毛細管電泳(CE)應用的重要組成部 分[1]。在蛋白質的毛細管電泳分離中，由於疏水作用 、靜電作用及其它因素[3~6]的存在，使得樣品在 毛細管內壁上產生吸附，導致嚴重的峰形拖尾、柱效低、重現性變差等問題，甚至樣品滯留在管內不出 峰。解決此問題通常有以下幾種方法[3’7]:極端pH值法(緩衝液的pH 8 ~ 11或pH <2);緩衝液中加人 小分子添加劑（如:季銨鹽、陽離子表麵活性劑、二胺類等）；毛細管內壁的改性，通過物理塗布或化學鍵 合的方法製備改性柱。前兩種方法隻能一定程度地減少吸附；pH過高或過低會引起蛋白質變性；添 加劑濃度過大也可導致蛋白質變性；電解質濃度過高還會導致電流增大，對分離效果都會產生負麵影 響。因此化學鍵合改性成為毛細管柱等分離通道處理最常用的方法[8]。此外，電滲流（EOF)的大小及 方向對分離效果影響較大，需要選擇合適的電滲流[9]。

本研究采用化學鍵合法製備改性柱以減輕蛋白質的吸附，通過改變酸、堿性單體的組成調節聚合物 的帶電狀態，從而有效調節電滲流，使之滿足分離的需要。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

DZF   6020恒溫幹燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）； P/ACE MDQ高效毛細管電泳儀(美國Beckman公司），配紫外檢測器、P/ACE數據采集工作站。1 mL 微量注射器。

烯丙基胺、乙烯基橫酸鈉、丙烯酰胺(單體亞甲基雙丙烯酰胺（交聯劑）、3-甲基丙烯酰氧丙 基三甲氧基矽烷（y-MAPS，98%，山東鵬浩化工）。其它試劑均為分析純。一次去離子水。毛細管 (75 jun i.d.，河北省永年銳灃色譜器件有限公司）；新鮮雞蛋。

2.2不同電荷聚丙烯酰胺改性柱的製備

毛細管預處理方法與文獻[10]基本相同。取一定長度的毛細管，分別用0.1 mol/L NaOH溶液和 水依次衝洗40 min，注人y-MAPS浸泡40 min，N2吹幹，120丈恒溫幹燥3 h。

取適量單體溶液溶於水，超聲至完全溶解。引入毛細管中反應40 min,N2吹幹，120 ^恒溫過夜。

2.3樣品溶液的製備

取鮮雞蛋蛋清，溶於8倍體積碟酸鹽-尿素緩衝液(pH 5.60)中。隣酸鹽、尿素濃度均為10 mmol/L, 輕搖至蛋清溶解，過濾,4弋保存備用。

2.4實驗方法

緩衝液使用前超聲脫氣10 min。分離柱每次實驗前用水和緩衝液依次衝洗5 ~ 10 min。正極端壓 力進樣後，施加一定電壓並啟動數據采集。電滲流標記物為硫脲（100 mmol/L)，溶於相應緩衝液中。

3結果與討論

3.1不同聚合物改性柱的電滲流

Table 1 Components of monomer solutions

單體 Monomer聚合物質量P〇丨ymer(g)

12345

丙稀醜胺Aery丨amide0.23320.24060.20430.21050.2011

JV , /V-亞平基雙丙稀酰胺 JV，iV-Methylene-bis-acrylamide0.08440.08290.05050.08920.0864

過硫酸按 Ammonium persulfate0.54420.42880.29880.56210.5110

乙鋪基磺酸納Sodium vinylsu丨fonate0.1691

稀丙基胺Allylamine0.14421.00323.4251

將所用試劑加入20 mL水，配製5份單體溶液(表1)，製備相應的改性毛細管柱,並與空柱進行對比。 表1單體溶液配比

根據單體溶液的組成，聚合物將含有不同酸性和堿性基團。由表i可見,聚合物i中含有磺酸基， 聚合後也帶有相同基團，在緩衝溶液中發生電離，使改性柱內壁帶永久負電荷;聚合物2不帶電，電滲流 源於未覆蓋矽羥基的電離;聚合物3 ~5含有氨基，在pH < 10的緩衝溶液中，其對應的改性柱內壁由於氨 基的電離，會(部分)抵消矽羥基形成的負電荷。

圖1是電滲流的變化曲線，柱1未進行改性，

>

0.1

0.0

6

柱2~6分別由表1中聚合物1 ~5改性。與柱1 相比，聚合物改性之後電滲流顯著降低。含磺酸 基的聚合物塗層柱2中電滲流降約為原來的 36% ;中性聚合物2改性後，電滲流進一步降低， 低於原來的1/4。隨著單體溶液中烯丙基胺的濃 度增大（聚合物3 ~5),相應聚合物中氨基密度提 高，導致電滲流較小。烯丙基胺濃度為50 g/L (約1 mol/L,聚合物4)時，電滲流降到7%左右。 進一步增大烯丙基胺的濃度，電滲流變化趨緩。 如果將烯丙基胺的濃度進一步增加到150 g/L (3 mol/L,聚合物5)時，電滲流相對變化<20% (圖1，柱6)。

根據上述改性方法，通過調整乙烯基磺酸鈉、 烯丙基胺的濃度及比例，即可方便地製備電滲流

0.9

，0.8丨 0_7

' 0.6 £ 0.5 0.4

S〇-3 〇 0.2 2

不同的改性柱，用以適應不同的分離目的，從而可能實現高效、快速的蛋白質分離。

3.2聚合物電荷不同對分離結果的影響

選取3根改性柱（圖1柱2, 3和5),其中的聚合物在所用緩衝溶液中帶電狀態不同，柱2聚合物含 磺酸基，帶負電;柱3聚合物不帶電;柱5聚合物含氨基，帶正電。在一定緩衝溶液中，各種聚合物的電 離狀態不同，預計將對電泳實驗產生不同影響。

3根柱子分別用於雞卵清蛋白質的分離。之所以選擇雞卵清蛋白作為樣品，是因為其不但方便易 得，而且主要蛋白質成分均有研究報道。結果如圖2,與非改性柱（結果未示出）相比，3根柱對蛋

白質吸附均有改善，保證了分離的順利進行。柱2 電泳圖（圖2a)顯示，聚合物塗層對蛋白質有一定 的吸附，尤其是其中的堿性組分如溶菌酶等，這應該 歸結於磺酸基的電離。柱3和5分別由中性、堿性 聚合物改性,電泳圖（圖2b和2c)峰形對稱，表明蛋 白質的吸附被進一步抑製。電泳圖2c與2b相比，

遷移時間更短，峰形更加對稱,說明堿性聚合物改性 柱抑製蛋白質吸附的效果最佳。

3.3緩衝液pH值對分離結果的影響

根據前述對改性柱分離度的比較,選擇堿性聚合 物改性的柱子(柱5)考察緩衝溶液對電泳的影響。

圖3是使用不同pH值緩衝溶液得到的電泳 圖。與圖2c比較可見，在所選實驗條件下，中性或 酸性條件下分離度變差，這是由於此時樣品組分，尤 其是堿性蛋白質荷正電，產生了靜電吸附。pH 5.33 比pH 7.08出峰數目更少。由此可見，適當增加緩 衝液的pH值可改善分離效果。本研究選用 pH 9.0-10.5 之間。

3.4緩衝液濃度對分離結果的影響

選擇柱5考察緩衝液濃度對分離的影響，結果如圖4 所示。隨著緩衝液濃度的增大，分離度明顯改善，樣品出峰 數增多。當濃度為300 mm〇l/L時，淌度相近的卵清蛋白和 卵球蛋白也得到了分離（圖4c)。這是因為高濃度緩衝液 可以更有效地抑製了蛋內質的吸附。從圖4還可見，緩衝 液濃度越大，分離時間越長。說明高濃度緩衝溶液同時減 小了電滲流[14’15]，從而延長了組分遷移時間。而緩衝液濃 度過高會產生過大的焦耳熱效應，最終會降低分離度及柱 的壽命。本實驗中BBS溶液濃度選擇200 mmol/L。

本實驗采用原位合成聚合物改性毛細管柱的方法。通 過改變聚合物單體的組成來改變毛細管內壁的帶電情況和 調節電滲流。結果表明，含有氨基基團的聚丙烯酰胺改性

的毛細管柱，能夠抑製蛋白質的吸附，電滲流降低了至少90%，可以用於蛋白質的電泳分離。