超氧化物歧化酶(EC1. 15. 1. 1，簡稱SOD)是廣泛存在於生物體內的一類金屬酶，根據金屬輔基的不 同可分為Mn-S0D、Fe-S0D和CuZn-SOD 3種類型，近年來還從鏈黴菌屬中發現了 Ni-S0Dtu，從日本沼蝦 中純化66. 1 ku的EC-S0D，發現了倉鼠和人胞質中的240 ~260 ku及135和270 ku的EC-SOD125，它們都 具有催化超氧陰離子自由基形成過氧化氫和水的反應能力，在防禦活性氧對生物體的傷害、在植物的逆境 生理、在預防和治療由自由基誘發的一係列疾病,如腫瘤、輻射損傷、心腦血管疾病等方麵都起到了很電要 的作用.對3種類型SOD同工酶的分離和鑒定是生物學和醫學中會遇到的實際問題，通常都是采用聚丙 烯酰胺凝膠電泳（PAGE)的定位染色法f3],我們在實際應用中發現樣品點樣量少時,SOD弱帶難以顯示， 點樣量大時植物次生物質對酶帶顯示有幹擾，且譜帶清晰度和重複性都不理想，時有譜帶重疊現象出現， 譜帶分離的/?/值與酶類型間無特定規律可尋，在改用聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳（GPGE)後得到了較滿意 的效果.本文將通過GPGE和PAGE的比較，旨在建立用GPGE分離和鑒定SOD同工酶的新方法.
1材料和方法
1.1材料、主要試劑及儀器
新鮮的植物材料采A南京地區和本院溫室，當天采集後，用蒸餾水洗淨後備用.
枸杞Fe-SOD、牛血SOD及花生CuZn-SOD分別按其文獻14〜純化至電泳純•丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰 胺、SDS、甲硫氨酸（Sigma) ,NBT(南京卓爾生化有限公司），其它試劑為閏產分析純或生化試劑.主要儀器 為島津CS -9000雙波長薄層掃描儀，CSR -4高壓電泳儀，梯度凝膠電泳灌膠裝置.
1.2方法
1.2. 1 SOD粗酶液的製備
將實驗材料剪碎，按每克鮮重加人3 mL的50 mm〇I/L磷酸緩衝液（PH7. 8)進行研磨勻漿，勻漿液 10 000 r/min離心15 min後，上清液即為枏酶液，用於實驗或分裝於小離心符內，-25T保存備用.
1.2.2SOD同工酶的電泳分離和染色定位
PAGE按羅廣華等[3]方法，在7. 5%或10%的分離膠上進行;GPGE按程光宇等m及張龍翔[8]方法，在 4% ~35%梯度膠上進行，加樣前以100 V穩壓預電泳30 min,加樣後在4T電泳，先以150 V穩壓電泳1 h 後，將電壓逐步提高到300 V穩壓電泳15 h(電泳持續4 500 V • h以上）；二次電泳按程光寧等w方法進 行，第一向為10%的PAGE，在電泳結束後切取具有SOD活性E未經染色的K帶，放在已預電泳過的4% ~35%梯度膠上端，加人PAGE中3. 5%的濃縮膠液，采用光照聚合將其固定後進行第二向GPGE,同時以 相同酶液量在梯度膠上點樣.電泳結束後進行酶活性染色，采用拍照或掃描方法記錄SOD同工酶圖譜.
1.2.3SOD同工酶類型的鑒定
(1)參照Bridges和Salin的方法[1°]，以KCN和H202兩種抑製劑鑒定SOD類型.
(2)利用梯度膠具有分子篩效應w及其/?/值與3種SOD相對分子質量存在差異[111的特點，由/?/值 初步判斷SOD類型.
(3〉利用CuZn-SOD對SDS不敏感、Mn-SOD和Fe-SOD對SDS敏感的特性[ll’m9]，向粗酶液中加入 SDS溶液使其終濃度達1 %後，於371保溫1 h,分別進行SOD同1：酶的GPGE和PAGE並進行酶活性染 色.CuZn-SOD對SDS不敏感，譜帶留存,Mn-SOD和Fe-SOD對SDS敏感，譜帶消失.
2結果與分析
2.1GPGE和PAGE對分離SOD同工酶的影響
結果見圖1.14種植物的3種類型SOD在4% -35%的梯度膠中都得到較好的分離，譜帶清晰，未見 有幹擾現象，根據/?/值可分為A、B、C 3個區域:A區的/?/值最小（<3. 6),譜帶都為1條;C區的/?/值最 大（>5.0)，其中譜帶數目因植物種類不同而異，如羊蹄、拔契僅有1 ~2條，而鴨趾草、馬兜鈴等則多於4 條;B區取值位於A、B區之間，如省譜帶一般都為1條，但許多植物缺乏這種類型譜帶.同時，從其/?/值 大小，還可初步判定各同工酶的相對分子質量和類型，取值最小的A區同T酶相對分子質量最大，應為 Mn-S0D;ft/最大的C區同工酶相對分子質量最小，應是CuZn-SOD;而介於兩者之間B區的同T酶可認為 是Fe-SOD，如南苜蓿、金蕎麥的Fe-SOD。
同一樣品在相同加樣量下進行10% PAGE,SOD譜帶分離效果遠不如GPGE,譜帶分布及/?/值與 SOD類型之間無特定規律可尋，其中紫花地丁中的次生物質對SOD顯示幹擾並影響到周圍的譜帶（圖1 的11).可見，在PAGE中SOD的/?/值因受電荷、膠濃度、pH值等多種因素影響，不能作為SOD類型鑒定 的依據，在GPGE中的切值棑除了電荷等因素的影響，與分子大小有相關性,故它可用於測定天然酶和蛋 白質的相對分子質量的靈敏度和分辨率比較
以牛血SOD為標準，比較GPGE和PAGE檢測SOD的靈敏度和分辨率（見圖2).當以相同加樣量分 別進行GPGE和PAGE時，在PAGE圖譜上S0D的檢測濃度為1. 56 x l〇_l3mol，在GPGE圖譜上，SOD濃 度為1. 56 x l〇-14m〇l時譜帶清晰，當再稀釋10倍後仍能見到SOD譜帶（圖片未列出），說明PAGE和 GPGE檢測SOD的靈敏度分別為1. 56 x 10 —l3mol和1. 56 x 1(T15mol.在GPGE圖譜中牛血SOD活性染色 與蛋白染色帶邊緣清晰，呈扁平狀，在1. 56 x 10_12mol SOD時活性染色帶可分辨出1條主帶和2條次帶 及1條弱帶（圖2中A3)，與6. 24 x l(T9m〇l SOD時的蛋白帶相互對應（圖2中B5);而在同樣加樣量下的 PAGE圖譜中譜帶邊緣模糊，隻能分辨出1條主帶和1條次帶（圖2中C10).說明GPGE比PAGE有更高 的分辨率.
花生SOD粗酶液（125 U/mL)分別以1 pL進行GPGE和PAGE時，在GPGE圖譜上Mn-SOD和CuZn- SOD譜帶非常清晰（圖2的13)，但在PAGE圖譜上已無明顯的譜帶（圖2的19) •花生CuZn-SOD在GPGE 中分別加樣〇. 016 jig和0. 128 (ig，在PAGE中分別加樣0. 032 jtg和0. 32 jig時，低、高濃度SOD譜帶掃描後峰麵積之比分別為1:3. 37和1:1. 54.從圖1和圖4還能看出南苜蓿、番茄、金蕎麥等在梯度膠上顯示出 4 ~5條帶，但PAGE圖譜上顯示2 ~3條.純化的枸杞Fe-SOD有3條帶，但在GPGE上的靈敏度和分辨率 明顯高於PAGE(圖3的4,9).可見,對於植物的粗酶液和純酶，GPGE同樣比PAGE有較高的靈敏度和分 辨率.
2.3不同膠濃度對3種SOD類型分離和鑒定的影響
枸杞和香櫞都含有3種類型S0D，它們在不同膠濃度下的分離結果見圖3.枸杞在7. 5% PAGE中有3 條Fe-SOD，它們的/?/最大,CuZn-SOD也有3條，它們的/?/居中，Mn-SOD不成條帶，很難確定•在10% 的PAGE中3條Fe-SOD帶上移已與第三條CuZn-SOD相重疊，Mn-SOD帶已能基本分清.同時可見在
7.5%和10%的PAGE中還存在CuZn-SOD抑製不完全的現象，經KCN和H202處理後在負極處的一些譜 帶性質也很難判斷;在4% ~ 35%的梯度膠中3種類型SOD譜帶完全分離，Fe-SOD帶上移至Mn-SOD和 CuZn-SOD間，與純化的Fe-SOD有相同的值.香櫞SOD在10%的PAGE中，有1條對KCN和H202都 敏感的CuZn-SOD譜帶，它的/?/值最小，Mn-SOD和Fe-SOD即使以抑製劑處理，也因未分離開和分辨率差 無法判斷.在4% ~35%的梯度膠中3種SOD同工酶都有規律地完全分開，/?/值最小的1條為Mn-SOD，甩 值較大的2條為CuZn-S0D，i?/值位於兩者之間的為Fe-SOD.
可見，枸杞和香櫞的3種SOD類型，它們在7.5%和10%的PAGE中分離難有規律可循，如香櫞 CuZn-SOD的/?/值在同工酶中最小（圖3D)，同為Fe-SOD,在枸杞中的/?/值最大（圖3A)，在朱拮中/?/值 卻最小（圖5A).當用KCN和H202鑒定SOD類型時，常有抑製不完全的現象，有的因譜帶重疊，即使采用 抑製劑也很難有結果，如香橡的Fe-SOD、Mn-S0D(圖3D)和朱桔的Mn-SOD、CuZn-S0D(圖5A).但在4% -35%梯度膠上，如存在Fe-SOD時，其取值總是位於Mn-SOD和CuZn-SOD之間，枸杞、香櫞和朱桔3種 類型SOD在梯度膠上均有此規律可尋.在梯度膠中以其取值大小判斷SOD的類型的結果與用抑製劑處 理的結果完全一致.
樣品經1% SDS處理後，以相同量分別進行GPGE和PAGE,結果見圖4.在梯度膠中，7種植物在A 區的SOD譜帶活性都被SDS抑製，無一例外，表明它們都是Mn-SOD;C區的SOD譜帶對SDS不敏感，為 CuZn-SOD,其中金蕎麥和還亮草都含有1條對SDS敏感的譜帶，但它們經KCN和H202處理譜帶消失，具 有CuZn-SOD的典型特征，這些譜帶的/?/值在經SDS處理前後一致• B區帶中被SDS抑製的為Fe-SOD, 其中代代花和南苜蓿的Fe-SOD的含量大於30%，金蕎麥、馬兜鈴、無花果、三葉草都含有對SDS敏感的 Fe-SOD(結果待發表）•經SDS處理後留存的為CuZn-SOD，而Mn-SOD和Fe-SOD譜帶消失，Mn-SOD和 Fe-SOD的區分則可根據它們在GPGE圖譜上的/?/值確定.由此可見，GPGE結合SDS處理是SOD類型鑒 定的有效途徑之一.
結果見圖5.朱桔在二次電泳（圖5C)中的a、b帶 對應於GPGE圖譜上的a、b帶（圖5B)和PAGE圖譜上 的a、b帶（圖5A)，分別為Mn-SOD和Fe-SOD,但在 PAGE圖譜上a帶/?/值大於b帶;c帶有2條為CuZn- S0D，在二次電泳和梯度膠中是相互對應，但在PAGE 圖譜上a、c帶混雜，從純化的Mn-SOD和CuZn-SOD的 PAGE圖譜上可看出a、c是重疊帶^.在二次電泳中 新、老葉中Fe-SOD活性都約占SOD總活性的30%，與 GPGE中的結果相當，但在PAGE中老葉這一比例約 30%，新葉低於5%.
從二次電泳中SOD譜帶在PAGE和GPGE中的對 應關係可看出，朱桔3種SOD類型在GPGE中能按照 分子大小有效地分離和鑒別，但在PAGE中SOD譜帶 有重疊現象，分離不徹底，新葉中的植物次生物質幹擾 了 SOD活性顯示，甚至無譜帶.
3討論
目前國內外在SOD同工酶的分離和鑒定研究中都是采用10%左右的PAGE，但分離效果和圖譜都不 很理想.我們在枸杞果實SOD研究中采用了 GPGE,並首次報道了枸杞含有Fe-S0DK]，在隨後的研究中陸 續發現了何首烏、香櫞等十幾種高等植物存在Fe-S0D[14].迄今為止國內外報道含Fe-SOD的高等植物僅 番茄、銀杏、睡蓮、芸苔、樟樹等十幾種U°’~9],SOD同工酶的分離也都是采用PAGE,我們的發現與用 GPGE替代PAGE研究SOD電泳技術改進密切相關，但對GPGE分離和鑒定SOD類型和SOD譜帶在 GPGE與PAGE中相互對應關係的研究H內外尚未見報道，本文對此進行了初步探討.
3.1 GPGE比PAGE能更有效地分離和鑒定SOD同工酶類型
本研究表明，在GPGE圖譜上的SOD譜帶可明顯分為A、B、C 3個區，A區/?/值最小，對SDS敏感，為 分子量最大的Mn-SOD;C區/?/值最大，對SDS不敏感，為相對分子質量較小的CuZn-SOD;B區的譜帶甩 值位於二者之間，經SDS處理後消失，為Fe-SOD•由於GPGE是根據孔徑大小分離酶和蛋白質，其ft/值與SOD分子大小有相關性[8]，使酶的分離和鑒定變得相對容易和簡單化，當結合SDS處理時能將CuZn-SOD 和Mn-SOD、Fe-SOD區分開，由於Fe-SOD的/?/值通常位於Mn-SOD和CuZn-SOD間，故可確定SOD類型. 本文中枸杞、朱拮、香櫞存在的3種SOD類型符合這一規律，當采用KCN和H202對枸杞、香櫞、金蕎麥和 還亮草等SOD類型進行鑒定時，結果與GPGE中各譜帶取值與SDS處理相結合來確定酶類型的結果一 致，說明了將GPGE中各譜帶/?/值與SDS處理的結果相結合是分離和鑒定SOD類型的一種簡便有效的 新方法.在傳統的PAGE中SOD譜帶受其所帶電荷、分子大小、膠濃度等多種因素影響,分離的取值變化 較大，如本文中Fe-SOD的/?/值在枸杞中最大，在朱桔中最小，/?/值與SOD類型及分子大小間無特定規律 可尋，鑒定SOD類型要采用KCN和H202等抑製劑，由於KCN為劇毒品，使SOD類型的研究受到了限製， 當酶帶相互重疊時甚至無法有結果（如香櫞、朱桔等）.可見，在SOD分離和類型鑒定方麵GPGE比PAGE 有更大的優勢和應用前景.
3.2GPGE分離SOD的靈敏度和分辨率
本文對GPGE和PAGE檢測SOD的靈敏度和分辨率進行了比較，結果表明，PAGE檢測牛血SOD靈 敏度為10_l3m〇l，GPGE檢測牛血SOD靈敏度可達10_15 mol.由於GPGE的靈敏度比PAGE高2個數量 級，可檢測到在PAGE圖譜上因含量很低難以顯示或活性低於5%的Fe-SOD譜帶（如馬兜鈴、無花果三 葉草等），它們的矽值都位於Mn-SOD和CuZn-SOD的B區之間.在GPGE圖譜中SOD譜帶清晰,點樣量 適中時為扁平形，邊緣明顯，有較高的分辨率，牛血SOD可清晰辨認出4條帶，番茄和朱桔粗酶液可分辨 出4 ~5條帶，在PAGE圖譜中因幹擾的存在大大影響了譜帶的分辨，它們的譜帶較模糊隻有2 ~3條.純 化的枸杞Fe-SOD在GPGE和PAGE中都有3條帶，但前者的靈敏度和分辨率明顯高於後者.高的靈敏度 和分辨率使實驗結果更準確可靠，可見，GPGE分離SOD特別是Fe-SOD是比PAGE更好的方法.
3.3GPGE分離和鑒定SOD的可靠性
本文發現在C區對SDS敏感的譜帶（金養麥和還亮草）也能被KCN和H202抑製為CuZn-SOD,說明 了以/?/值來判斷SOD類型是可靠的.植物材料中的次生物質豐富，它們會與SOD結合影響酶顯示[20]，朱 桔Fe-SOD(新葉）和何首烏Mn-SOD(圖片未列出）在PAGE中幾乎無帶，在GPGE中含量都達30%左右， 與二次電泳結果一致，提示在GPGE中經長時間電泳後幹擾物可能與SOD分離泳出凝膠，能真實反映出 全部SOD譜帶，而PAGE會造成一些SOD的漏檢.SOD譜帶在GPGE和PAGE中對應關係由二次電泳反 映出來，GPGE中的SOD譜帶通過二次電泳都能和PAGE的相互對應,說明了 GPGE分離和鑒定SOD的 結果是可靠的，但PAGE中3種SOD類型的/?/值變化很大,與酶類型間無相關性，同時，通過二次電泳還 可以看出，GPGE對在PAGE上重疊和有幹擾的SOD譜帶的分離和鑒定是有效的.