聚丙烯酰胺降解菌的篩選及降解含聚丙烯酰胺汙水的室內研究:
聚丙烯酰胺降解菌的篩選及降解含聚丙烯酰胺汙水的室內研究,近年來，我國東部的大多數油田基本上已經進入高含水開發後期，傳統的水 驅已不能滿足采油的需要，聚合物驅油技術在老油田中得到廣泛的推廣。部分水 解聚丙烯酰胺在為油田提高采收率的同時，對當地環境也產生了相當大的危害。 首先，含聚汙水處理遇到很大問題，油水分離難度加大，采出水含油量嚴重超標; 含聚汙水處理成本、難度加大，且部分含有較高濃度的聚丙烯酰胺采出水外排。 其次，由於地層結構原因，聚丙烯酰胺在進入地下油層的同時很難避免滲透到地 下水層。殘留在環境中的聚丙烯酰胺會發生緩慢降解，釋放出有毒的丙烯酰胺單 體。聚丙烯酰胺在地麵水體和地下水中的長期滯留，必將對當地水環境造成潛在 的危害。目前，聚丙烯酰胺的應用範圍和規模正呈現快速增長趨勢，同時其在環 境中的累積、遷移、轉化帶來的毒性亦將逐漸顯露出來，並將給生態環境帶來不 可估量的危害。因此，含聚汙水的處理成為亟待解決的問題。由於微生物特殊的 環境適應性、高繁殖速率和變異性，利用高效降解聚丙烯酰胺的菌株處理含聚汙 水將成為解決由聚丙烯酰胺引起的環境問題的有效手段。
本論文以聚丙烯酰胺為研究對象，對生化法處理含聚聚丙烯酰胺汙水進行了 探討。在對聚丙烯酰胺的影響因素考察的基礎上優化了生物降解體係中聚丙烯酰 胺的評價方法，篩選出對聚丙烯酰胺有一定降解能力的菌種，並對降解條件進行 了優化優化，初步探討了聚丙烯酰胺好氧降解機理，並將降解菌應用於生化處理 模擬實驗。得出了以下結果：
1.pH值、光照和礦化度對聚丙烯酰胺的粘度影響較大，聚丙烯酰胺降解菌的篩選及降解含聚丙烯酰胺汙水的室內研究,而對於聚丙烯酰胺 的濃度影響較小。低溫和弱的機械剪切對聚丙烯酰胺的粘度和濃度影響都不大， 而高溫和強的機械剪切對聚丙烯酰胺的粘度和濃度影響都比較大。對聚丙烯酰胺 的評價方法進行了優化，以濃度評價聚丙烯酰胺降解為主，粘度和分子量評價為 輔；在濃度評價方法中采用澱粉-碘化鎘法，並對其測定條件中的緩衝溶液的pH 值進行了優化，測定的緩衝溶液的最佳pH值為3.5。
2.初步篩選到三株好氧的聚丙烯酰胺降解菌種，分別命名為PM-2、PM-3、
PM-4。通過生理生化性質和16S rDNA鑒定，PM-2為蠟樣芽胞杆菌，PM-3為枯
草芽孢杆菌，PM-4為蒼白杆菌。將三株菌進行混合正交培養後，優化出PM-2 與PM-3的混合菌降解效果最好，300 mg"L-1聚丙烯酰胺溶液的降解率最高可達到 42%。優化了混合菌降解條件，最佳降解時間為3天，連續活化次數為4次，接 種體積分數為3 %，溫度為35 - 45 °C，初始pH值為6.0-7.5，搖床轉速為140 r-min-1，礦化度為 2500 -10000 mg-L-1。
3.探討了細菌對聚丙烯酰胺的利用情況，結果表明聚丙烯酰胺既可以作為 氮源利用也可以作為碳源利用，通過掃描電鏡、紅外分析、差熱分析、紫外分析 以及液相分析等手段對生物降解前後的樣品的表征的基礎上對微生物好氧降解 聚丙烯酰胺的機理進行了初探。在其分泌的胞外酰胺酶的作用下聚丙烯酰胺先被 作為氮源利用，在其生長和代謝過程中，聚丙烯酰胺被斷裂為小分子有機物，又 可以作為碳源被細菌利用。
4.在對含聚汙水水質分析和可生化性分析的基礎上對汙水進行可生化性調 整。運用生物接觸氧化法對汙水進行了生化處理模擬實驗。模擬實驗分為靜態模 擬和動態模擬兩部分進行。靜態模擬實驗中，降解7天後，聚丙烯酰胺降解率達 到80 %，原油總的去除率為95 %，COD&的總的去除率達到86 %。動態模擬 試驗中，生化處理3天以後，出水的各項指標趨於穩定，聚丙烯酰胺的降解率達 到67 %，原油總的去除率為93 %，出水的COD&總的去除率達到80 %。
部分水解聚丙烯酰胺（partially hydrolyzed polyacrylamide，HPAM)以其相
對高分子量和低濃度水溶液的高粘性而被廣泛用來提高原油的采收率 。近年 來，我國東部的大多數油田基本上已經進入高含水開發後期，使用HPAM進行 三次采油已經得到廣泛地應用。隨著聚合物驅油技術在我國油田的大麵積推廣， 含聚丙烯酰胺汙水的產量在逐年增加。聚丙烯酰胺在為油田生產提高原油采收率 的同時，也大幅度增加了混合液的粘度和乳化性，使油水分離難度加大，造成采 出水含油量嚴重超標。含聚丙烯酰胺汙水具有粘度高、油水分離難度大、可生化 性差等特點，對環境的負麵影響也越來越明顯。含聚汙水的處理已經成了一個亟 待解決的問題。然而現有工藝無法滿足處理要求，需要對聚丙烯酰胺降解的途徑 和機理進行全麵深入地研究，尋找合適的處理方法。
作為對環境汙染物高效的處理手段，由於其技術上的成熟、無二次汙染和其 低廉的運行費用，微生物降解與處理工藝已經在各種難降解汙染物的無害化處理 領域發揮著核心作用。微生物降解與其特有的無害化處理將成為解決聚丙烯酰胺 引起環境汙染和轉化的潛在毒性問題的有效手段[2]。
本論文是以勝利油田含聚汙水為研究對象，初步篩選出對聚丙烯酰胺具有一 定降解能力的菌種，並應用於室內生化模擬實驗。論文研究將為油田含聚汙水的 達標處理回注奠定理論基礎，為油田可持續發展提供技術支撐；同時也為近海油 田的采出汙水的處理提供借鑒，對海洋環境的保護也有一定的現實意義。
1研究背景
1.1聚丙烯酰胺的簡介
聚丙烯酰胺是丙烯酰胺及其衍生物的均聚物和共聚物的統稱[3]。
1.1.1聚丙烯酰胺的發展曆史
聚丙烯酰胺(polyacrylamide，PAM)最早在1893年由Moureu用丙烯酰氯與 氨反應製得的。1954年首先在美國實現商業化生產。當時，丙烯酰胺（acrylamide， AM)是由丙烯腈（acrylonitrile，AN)經硫酸水合而得。70年代以來，隨著AM 的第二代技術生產技術——催化水合法，及第三代生產技術——微生物法相繼問 世，PAM係列產品不斷被開發，PAM生產技術也不斷發展和進步。
從品種上講，最先實現的是非離子聚丙烯酰胺（nonionic polyacrylamide， NPAM)隨後出現的是部分水解聚丙烯酰胺（HPAM)。20世紀70年代，美國 Merck公司和Halliborton公司首先研製成功888电子游戏官网（cation
polyacrylamide，CPAM)二甲基二烯丙基氯化銨均聚物（polydimethyldiallyl
ammoniumchloride，PDMDAAC)和二甲基二烯丙基氯化銨與丙烯酰胺共聚物（P (DMDAAC/AM))，並很快投入工業化生產。到1980年，在日本隨著陽離子單 體丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨（acryloxyethyl trimethylammonium chloride， AETAC)開發成功，AETAC的均聚物和共聚物888电子游戏官网（PAETAC， P(AETAC/AM))也相繼投入生產，到1987年全日本的生產能力已經達到17750 t-a-1。到 1990 年代，兩性聚丙烯酰胺（amphoteric polyacrylamide，AmPAM)的 研究趨於活躍，不久AmPAM就進入市場並被廣泛應用。到目前，丙烯酰胺和丙 烯酰胺衍生物的均聚物和共聚物品種數以不下百種，新的品種還在不斷地被開發 出來。
PAM的優良的水溶性、增稠性、絮凝性、化學反應活性、以及經過改性產品 的多樣性，使PAM顯示出廣闊的應用前景和巨大的市場潛力。在此刺激下，從上 個世紀50年代以來，有關PAM的研究與開發非常活躍，其工業產品劑型從最初
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的水溶膠、發展到粉劑、乳液（油包水乳液)、水分散型（又稱水包水乳液）等[4]。 1.1.2聚丙烯酰胺的結構式
按水溶性分類，聚丙烯酰胺分為兩種。一種為線性的、水溶性的聚丙烯酰胺， 一種交聯的、非水溶性的但能包含吸收大量水的聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺凝膠）。
聚丙烯酰胺凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯成的，聚丙烯酰胺降解菌的篩選及降解含聚丙烯酰胺汙水的室內研究,經幹 燥粉碎或加工成型製成粒狀，控製交聯劑的用量可製成各種型號的凝膠，交聯劑 越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠一P (Bio-Gel P)，有日本tosoh 的TSKGEL的pw係列，適合蛋白和多糖的純化，即丙烯酰胺和少量交聯劑甲叉雙 丙烯酰胺，在催化劑過硫酸銨作用下聚合形成凝膠。其結構式如下[5]:
圖1-1交聯聚丙烯酰胺凝膠結構式 Fig.1-1 Structural formula of crosslinked polyacrylamide gel
線性的聚丙烯酰胺親水性高，能以各種百分比溶於水，不溶於大多數有機溶 液。它是應用最廣泛的水溶性高分子化合物之一。如下圖所示：
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圖1-2—種線性聚丙烯酰胺的結構式 Fig.1-2 Structural formula of a linear polyacrylamide
按電性分類，聚丙烯酰胺有非離子型、陰離子型、陽離子型和兩性離子型。
H H
I I
C—C-
H
U
O
I
NH
2
(1)非離子型（均聚物）
非離子聚丙烯酰胺（NPAM)由丙烯酰胺單體聚合製得。
(2)陰離子型（共聚物）
H H
I I
C—C
H卜〇 NH2
HH
1 1
■C—C ——
I I
H ?=〇
OH-
門
由非離子型聚丙烯酰胺水解或丙烯酰胺與丙烯酸共聚製得。
陰離子聚丙烯酰胺（APAM)的分子量從600萬到2500萬水溶解性好，能 以任意比例溶解於水且不溶於有機溶劑。有效的pH值範圍為7到14,在中性堿 性介質中呈高聚合物電解質的特性，與鹽類電解質敏感，與高價金屬離子能交聯 成不溶性凝膠體。陰離子型聚丙烯酰胺習慣上也稱為部分水解聚丙烯酰胺 (HPAM)。
(3)陽離子型（共聚物）
由丙烯酰胺(AM)與二烯丙基二甲基氯化銨(DADMAC)、丙烯酰氧乙基三甲 基氯化銨(AETAC)等其他單體共聚製得。
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:〇
NH
2
n
NHCH2NR2.HCl
888电子游戏官网（CPAM)的分子量從800萬到1500萬。離子度從20 % 到55 %水溶解性好，能以任意比例溶解於水且不溶於有機溶劑。有效的PH值 範圍為1到14，呈高聚合物電解質的特性。
(4)兩性離子型（共聚物）
H H
I I
C—C—
C 一
HC—
NH2
HH
C—C —
I l_
H C一〇 OH-
H
H
C 一 C=O
」
NHCH2NR2.HCl
兩性離子聚丙烯酰胺就是分子內即含陽離子基又含有陰離子基。
兩性離子聚丙烯酰胺（AmPAM)因分子內含陽離子基和陰離子基，它具備 了一般陽離子絮凝劑的使用特點外，表現了更優異的性能。可在大範圍的pH值 內使用，具有更高的濾水量，較底的濾餅含水率。兩性離子型絕非陰離子型、陽 離子型的混合。如果把888电子游戏官网與陰離子聚丙烯酰胺配合使用則會發生 反應產生沉澱。所以兩性離子產品最為理想 。
1.1.3聚丙烯酰胺的應用
由於聚丙烯酰胺具有高分子化合物的水溶性以及其主鏈上活潑的酰基，因而 在石油開采、水處理、紡織印染、造紙、選礦、洗煤、醫藥、製糖、養殖、建材、 農業等行業具有廣泛的應用，有“百業助劑”、“萬能產品”之稱[7]。
1)水處理領域
PAM在水處理工業中的應用主要包括原水處理、汙水處理和工業水處理3 個方麵。在原水處理中，PAM與活性炭等配合使用，可用於生活水中懸浮顆粒 的凝聚和澄清；在汙水處理中，PAM可用於汙泥脫水；在工業水處理中，主要 用作配方藥劑。在原水處理中，用有機絮凝劑PAM代替無機絮凝劑，即使不改
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造沉降池，淨水能力也可提高20 %以上。所以目前許多大中城市在供水緊張或 水質較差時，都采用PAM作為補充。在汙水處理中，采用PAM可以增加水回 用循環的使用率。
2)石油采油領域
在石油開采中，主要用於鑽井泥漿材料以及提高采油率等方麵，廣泛應用於 鑽井、完井、固井、壓裂、強化采油等油田開采作業中，具有增粘、降濾失、流 變調節、膠凝、分流、剖麵調整等功能。目前我國油田開采已經步入中後期，為 提高原油采收率，目前主要推廣聚合物驅油和三元複合驅油技術。通過注入聚丙 烯酰胺水溶液，改善油水流速比，使采出物中原油含量提高。目前國外聚丙烯酰 胺在油田方麵的應用不多，我國由於特殊的地質條件，大慶油田和勝利油田已經 開始廣泛采用聚合物驅油技術。
3)造紙領域
PAM在造紙領域中廣泛用作駐留劑、助濾劑、均度劑等。它的作用是能夠 提高紙張的質量，提高漿料脫水性能，提高細小纖維及填料的留著率，減少原材 料的消耗以及對環境的汙染等。在造紙中使用的效果取決於其平均分子量、離子 性質、離子強度及其它共聚物的活性。非離子型PAM主要用於提高紙漿的濾性， 增加幹紙強度，提高纖維及填料的留著率；陰離子型共聚物主要用作紙張的幹濕 增強劑和駐留劑；陽離子型共聚物主要用於造紙廢水處理和助濾作用，另外對於 提高填料的留著率也有較好的效果。此外，PAM還應用於造紙廢水處理和纖維 回收。
4)紡織印染工業
在紡織工業中，PAM作為織物後處理的上漿劑、整理劑，可以生成柔順、 防皺、耐黴菌的保護層。利用它的吸濕性強的特點，能減少紡細紗時的斷線率； PAM作後處理劑可以防止織物的靜電和阻燃；用作印染助劑時，可使產品附著 牢度大、鮮豔度高，還可以作為漂白的非矽高分子穩定劑；此外，還可以用於紡 織印染汙水的高效淨化。
5)其他領域
在采礦、洗煤領域，采用PAM作絮凝劑可促進采礦、洗煤回收水中固體物 的沉降，使水澄清，同時可回收有用的固體顆粒，避免對環境造成汙染；在製糖 6 工業中，可加速蔗汁中細粒子的下沉，促進過濾和提高濾液的清澈度；在養殖工 業中，可改善水質，增加水的透光性能，從而改善水的光合作用；在醫藥工業中， 可用作分離抗菌素的絮凝劑、用作藥片的賦型粘接劑以及工藝水澄清劑等；在建 材工業中，可用作塗料增稠分散劑、鋸石板材冷卻劑以及陶瓷粘接劑等；在農業 上，可作為高吸水性材料可用作土壤保濕劑以及種子培養劑等。在建築工業中， 可以增強石膏水泥的硬度，加速石棉水泥的脫水速度。此外，還可用作天然或合 成皮革的保護塗層以及無機肥料的造粒助劑等。
1.2聚丙烯酰胺在油田提高采收率的應用
廣泛用於油田提高原油采收率聚丙烯酰胺的產品為陰離子的水溶性部分水 解聚丙烯酰胺（HPAM)。
在我國能源日趨緊張的情況下，石油能源的合理開發利用已引起人們的極大 重視，因此，提高采油率已成為石油開采研究的重大課題。我國國內主要油田都 進入開發後期，含水率迅速上升，現有的注水技術已難以滿足油田的需要。聚合 物驅三次采油日趨成為提高采收率的一個重要方法[8]。
1.2.1聚合物驅油
通常把利用油層能量開采石油稱為一次采油；而在一次采油後，通過注水或 非混相注氣提高油層壓力並驅替油層中原油的驅油方式稱為二次采油；而在利用 天然能量進行開采和傳統的用人工增補能量(注水、注氣)之後，利用物理的、化 學的、生物的新技術來改善油、氣、水及岩石相互之間的性能進行尾礦采油的開 發方式，稱為三次采油。目前世界上已形成三次采油的四大技術係列，即化學驅、 氣驅、熱力驅和微生物采油。其中化學驅包括聚合物驅、表麵活性劑驅、堿水驅 及其複配的三元複合驅等[9]。
各種提高采收率方法中，聚合物驅油是目前潛力最大、具備工業化試驗和推 廣生產的主要方法，可以經濟、有效地提高原油采收率；周期短，見效快；聚合 物驅以擴大波及體積為主，因此它更適用於非均質的中質或較重質的油藏；油藏 滲透率高，利於聚合物驅；適用的油藏原油粘度範圍一般約為5-60 mPa_s[10]。
聚合物驅油在美國始於20世紀50年代末，從70年代到80年代中期，美國
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共進行聚合物驅礦場試驗183次，采收率最高提高8.6 %。此外，在前蘇聯的奧 爾良油田和阿爾蘭油田、加拿大的HorseflyLake油田和Rapdan油田、法國的 Chatearenard油田和Courtenay試驗區及德國、阿曼等，也都進行了聚合物驅油工 業性試驗，一般提高原油采收率6 %〜17 %[11]。
國內的三次采油技術在20世紀90年代發展很快，繼大慶油田之後,勝利、 大港、河南、遼河等油田也都進行了先導性試驗，並取得了成功。其中，大慶油 田、勝利油田等大型油田已形成注聚采油的規模生產,2003年大慶油田聚合物驅 油生產原油已達到年產1000萬噸以上。2005年，勝利油田聚合物驅三次采油累 積增油1000萬噸。目前，我國大型油田已成為聚丙烯酰胺的最大應用領域[12]。
聚合物驅油是通過在注入水中加入一定量的高相對分子質量的聚丙烯酰胺 (一般是陰離子型的），增加注入水的粘度，改善油水流度比，延緩油井含水率 的上升速度，從而改善油藏開采效果，提高油田采收率。
聚丙烯酰胺水溶液作驅油劑又叫稠化水驅或增粘水驅。其驅替機理主要是通 過減少水油的流度比，減少水的指進，達到活塞式驅替，以提高驅油劑的波及指 數，從而提高油層的采收率[13]。
聚合物分子是一種柔性大分子，在油層多孔介質中驅油時可形成長鏈狀或團 狀，它與原油的作用，是通過C-H鍵和外部H原子與油膜表麵分子的摩擦和碰撞 而發生的。在聚合物驅油過程中，由於分子的相互粘連、碰撞而使聚合物分子不 斷儲存和釋放彈性能，使更多的不動油變為可動油，從而提高驅油效率。一般情 況下在與水驅相同的流速下，聚合物分子與岩石、油滴、油膜界麵分子的相互作 用，使其C-H鍵上存儲有彈性能，而使表麵原子與原油分子發生作用力更大的碰 撞，從而使更多的原油分子從油相上分離並與注入劑一起在溶液中運動。聚合物 分子的彈性能越大，驅動原油的力就會越大。隨著聚合物溶液流速的增高，聚合 物分子對原油分子的衝擊和碰撞加劇，摩擦力也增大，從而使驅油效率增高[14]。
1.2.2聚合物驅油存在的問題
雖然聚合物驅已形成了較為完善的配套工藝技術，但遇到的問題也逐漸增 多。聚丙烯酰胺高溫易水解，高溫高鹽情況下易從溶液中沉澱出來，溶液粘度對 溫度和鹽度非常敏感，在高溫高鹽環境中溶液的保留粘度很低，受地層的剪切作
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用粘度下降也很大[15]。所以，聚丙烯酰胺降解菌的篩選及降解含聚丙烯酰胺汙水的室內研究,聚合物溶液粘度的穩定性一直是影響聚合物驅的 關鍵問題[16]。
另外，這種方法需要的地麵設施複雜，要建注聚站；微量汙染和凝膠會引起 地層堵塞；聚合物驅後油藏的滲透率降低；注入的聚合物質量要求高，與地層水 及其添加劑配伍性好，要有長期的熱穩定性、化學穩定性和生物穩定性；對於高 溫高鹽油田，實施聚合物驅困難和風險較大[17]。
同時，在聚合物驅油大力推廣時，也有些礦場試驗沒成功，其原因很多，可 動油飽和度低、原油粘度高以及地麵處理問題等，其中水質不達標也是造成礦場 試驗失敗的一個重要因素[18-19].
1.2.3聚合物驅油對環境的危害
聚丙烯酰胺在為油田生產提高采收率的同時，對其采出液的處理遇到很大問 題。注入地層的聚丙烯酰胺隨原油/水混合液進入地麵油水分離與水處理終端， 大幅提高了混合液的粘度和乳化性，使油水分離難度加大，造成采出水含油量嚴 重超標。聚丙烯酰胺對環境的直接影響是油田生產過程中部分汙水外排。由於油 田配製聚丙烯酰胺需要新鮮水和以及部分低滲透地層，使部分含有較高濃度的聚 丙烯酰胺采出水外排。絕大多數的聚丙烯酰胺進入地下油層，由於地層結構原因， 很難避免其滲透到地下水層。聚丙烯酰胺在地麵水體和地下水中的長期滯留，必 將對當地水環境造成潛在的危害[12]。
聚丙烯酰胺本身是安全無毒的，但是其單體丙烯酰胺是一種有毒化學物質， 對其毒性國內外已經進行了大量的研究[2〇]。對於環境中的丙烯酰胺濃度各國都 有相應的法律法規：美國職業安全與衛生法(OSHA)規定職業接觸標準是空氣中 丙烯酰胺的閾值-時間加權平均(TLA - TWA)為0.3 mg-m-3 [21];英國規定飲料中丙 烯酰胺含量< 0.25X10-6 g.L-1 [22]；日本規定向河水中排放丙烯酰胺含量< 10x10-6 g-L-1；我國費渭泉等提出，丙烯酰胺在水中的剩餘濃度< 10x10-6g.L-1。由於其 良好的水溶性，排入環境的丙烯酰胺基本上進入地麵水體和地下水中[12,23]。
丙烯酰胺長期與皮膚接觸可引起皮炎，直接接觸可引起眼睛發炎；過分曝露 於高濃度蒸汽700 mg_kg-1中導致眼睛和呼吸道感染，會引起頭痛、頭昏、嗜睡和 對其他中樞神經係統造成影響甚至死亡，吸入微量丙烯酰胺會引起嚴重的肺部傷
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害甚至死亡。動物試驗結果顯示，丙烯酰胺是一種可能致癌物。職業接觸人群的 流行病學觀察表明，長期低劑量接觸丙烯酰胺會出現嗜睡、情緒和記憶改變、幻 覺和震顫等症狀，伴隨末梢神經病（手套樣感覺、出汗和肌肉無力）[24]。
殘留在環境中的聚丙烯酰胺會發生緩慢降解，包括物理降解（熱降解、機械 剪切作用）、化學降解（水解、氧化以及催化氧化）和生物降解（微生物酶解）[7]， 釋放出有毒的丙烯酰胺單體，這將給當地環境帶來巨大的長期的影響。
1.3聚合物驅油產出汙水的處理
目前，聚丙烯酰胺的應用範圍和規模正呈現快速增長趨勢，同時其在環境中 的累積、遷移、轉化帶來的毒性亦將逐漸顯露出來，並將給生態環境帶來不可估 量的長期危害。因此，含聚汙水的處理成為亟待解決的問題。
對於含聚汙水處理技術主要包括物理方法、化學方法和生物方法。
1.3.1物理方法
物理法處理技術就是采油含聚汙水經預處理，在沉降罐中經自然沉降，除去 浮油及大顆粒雜質，再經粗粒化，進行二次沉降和過濾，除去細小油滴及未沉降 的懸浮物[25]。單純的物理方法對於含聚汙水的處理根本達不到油田回注水的指 標，而且對殘餘的聚丙烯酰胺未作任何處理，對於環境的危害仍然存在。
1.3.2化學方法
處理含聚汙水化學方法主要有添加化學助劑絮凝沉降法和氧化法（傳統氧化 法、催化氧化法和電化學方法）。
添加破乳劑、浮選劑和絮凝劑絮凝沉降是目前實際應用中較多的手段，它與 物理方法結合能有效去除汙水機雜和油滴。其中，888电子游戏官网處理含聚汙 水具有良好的效果。其缺點：一是藥劑價格太高導致現場運行成本高；二是絮凝 廢棄物無法處理，二次汙染環境[26]。
氧化法其原理是利用強氧化劑、光能或其他能量催化產生自由基引發自由基 的連鎖反應使長的聚丙烯酰胺分子鏈斷裂變成小分子有機物，最終被氧化降解為 無機物。目前研究較多的氧化劑有Fenton試劑[27]、高鐵酸鉀[28]等。催化氧化法有
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非均相光催化法[29]和多相催化氧化法[30]，此外，陳武等[31]研究使用電化學方法
去除聚丙烯酰胺。
傳統的氧化方法隻能將聚丙烯酰胺轉化為小分子有機物，但汙水的COD值 卻沒有明顯下降。其一次投資和運行費用高，且易造成二次汙染。電化學方法尚 處於實驗研究階段；光催化降解可在常溫、常壓下進行，光催化技術能徹底破壞 聚丙烯酰胺，不產生二次汙染。且費用較低，能除去低濃度的聚丙烯酰胺，是一 種潛在的、非常有發展前途的、對環境友好的含聚汙水處理技術[29]。
1.3.3生物方法
生物方法處理含聚汙水主要是利用微生物通過其特定酶的作用，以聚丙烯酰 胺為營養源，在其生長和代謝過程中將聚丙烯酰胺轉化為小分子有機物和無機 物。微生物對聚丙烯酰胺的降解分為好氧和厭氧兩個過程。好氧分解是以聚丙烯 酰胺的酰胺基為氮源，在其生長過程中，將大分子的聚合物降解為小分子的有機 物，進而利用小分子有機物為碳源對其進行徹底降解。厭氧分解是在厭氧環境中， 部分水解聚丙烯酰胺的酰胺基或羧基被還原為醛或醇，在此過程中，長鏈分子斷 裂為更易被微生物利用的短鏈分子，並最終降解為對環境友好的物質。
作為對環境汙染物高效的處理手段，由於其技術上的成熟、無二次汙染和其 低廉的運行費用，微生物降解與處理工藝已經在各種難降解汙染物的無害化處理 領域發揮著核心作用。已有研究結果表明，在聚丙烯酰胺的轉化過程中，生物催 化、氧化扮演了重要作用。由於微生物特殊的環境適應性、高繁殖速率和變異性, 微生物降解與無害化將成為解決聚丙烯酰胺引起環境汙染和轉化的潛在毒性問 題的有效手段[2]。
但目前對以聚丙烯酰胺為底物的生物降解研究比較少，已公開的聚丙烯酰胺 的生物降解率都比較低，尋找高效降解聚丙烯酰胺的微生物是研究者下一步的工 作目標。
1.4生物降解聚丙烯酰胺的研究進展
對聚丙烯酰胺的生物降解最早由1978年Suzuki等[32]研究開始的。研究者對 聚丙烯酰胺的降解大都集中在聚丙烯酰胺能否被降解以及是被微生物作為碳源
11
還是作為氮源利用這幾個方麵。大多數研究者認為聚丙烯酰胺不能被微生物完全 降解，隻能被部分降解。即使被氧化或光降解後的小分子量的聚丙烯酰胺也具有 很強的生物抗性。
由於聚丙烯酰胺在國外很少用於油田聚合物驅油，而用於灌溉田中保持土壤 中的水分和作為絮凝劑的應用很廣泛，所以國外研究者的研究一般集中在聚丙烯 酰胺在土壤中的應用對於微生物群落和土壤生態環境的影響以及作為絮凝劑沉 澱後的廢渣對存放處環境的影響。在國內，最早由1999年黃峰等研究了硫酸鹽 還原菌對聚丙烯酰胺的降解[33-35]。由於聚合物驅在油田的大範圍使用以及含聚汙 水的逐年增加，國內研究者對於含聚丙烯酰胺汙水的處理研究逐漸增多。但總體 來看，對聚丙烯酰胺的生物降解研究仍處於初步階段。
1.4.1降解聚丙烯酰胺的典型種群
表1是國內外研究者篩選出的能降解聚丙烯酰胺的微生物種群。由表中可以 看出降解聚丙烯酰胺的微生物種類比較豐富，有細菌、放線菌、古菌和真菌等。
表1聚丙烯釀胺降解菌的典型種群 Table 1 The typical strains of HPAM-biodegradation
降解菌種群研究者描述的菌種形態菌種出處研究者
產堿假單胞菌單個狹長的近橢圓狀，極 生多鞭毛，革蘭氏陰性， 好氧。大慶油田含聚廢水馴化的 好氧顆粒汙泥孫曉君等[36]
PM-1芽孢杆菌屬勝利油田聚丙烯酰胺驅油 產出液包木太等[37]
假單胞菌屬菌株 PD-1杆狀，革蘭氏陰性菌大慶油田聚丙烯酰胺驅油 產出液李蔚等[38]
硫酸鹽還原菌—油田現場取樣黃峰等[33-35] El-Mamouni
等間，
程林波等[56]
腐生囷—油田現場取樣黃峰等[40]
黃孢原毛平革菌—實驗室自備韓昌福等[41]
白腐真菌————實驗室自備Sutherland
12
等[42]
該菌細胞呈直杆狀芽孢
褐栗芽孢杆菌 JHW-L橢圓中生，菌落濕潤，淺 栗褐色，不透明，革蘭氏 染色陽性，屬於兼性厭氧篩選自大慶油田含HPAM 的產出液劉永建等[43]
細菌
Enterobacter HPAM Degraded 巳acteria I8該菌株為短杆狀，革蘭氏 陰性，黑色圓形菌落表麵 凸起、光滑、邊緣整齊，大慶油田六廠喇I聚合物 配注站魏利等[44]
兼性厭氧
Clostridium.杆狀，黑色圓形菌落，為大慶油田采油五廠十三區魏利等[45]
stickland CMW梭菌屬的新種聚合物配注站的母液罐
Anaerofilum pen-tosovorans A9革蘭氏陽性，短杆狀，具 有硫酸鹽還原功能，產 H2S，兼性厭氧大慶油田常規汙水回注工 藝采油的采出液魏利等[46]
降解菌G1—天津市工業微生物研究所 保藏菌種高年發等[47]
2株降解菌A和BA為成團杆菌，兼性厭氧； B為巨胞氮單胞菌，好氧日本北海道大學校園Kunichika N 等[48]
3株兼性菌編號分別 為ML1、ML2和ML3ML1屬於假單胞菌屬，ML2 和ML3屬於梭狀芽孢杆菌
屬某油田含聚合物產出水李宜強等[49]
JHW-1和JJH屬於芽孢杆
4 株 JHW-1、JHW-3、菌屬，JHW-3屬於梭狀芽大慶油田聚丙烯酰胺驅油郝春雷等[50]
JJF、JJH孢杆菌屬，JJF屬於假單產出液
胞杆菌屬
SHB，MRT，P178， PHL和gwn5菌株菌種的大小為0.8〜 2.0叫，形態有棒狀、節
杆等，屬兼性厭氧菌。大慶油田各采油廠聚合物 區塊廖廣誌等[51]
13
七株HPAM降解菌分別歸類於放線杆菌綱， a-變形菌綱和芽孢杆菌某汙水處理廠曝氣池佘躍惠等[52]
17株混合菌HC-1、HC-2、HC-3、HC-4、 HC-6、HC-7、HC-9、 HC-11、HC-12、HC-13、 HC-14、HC-15、HC-17南陽采油一廠注聚聯合站 的含聚合物廢水和該站配高玉格等[53]
為芽孢杆菌屬；HC-8為 節細菌屬;HC-5和HC-16
為黃杆菌屬；HC-10為不
動細菌屬製聚丙烯酰胺溶液所清除 的罐底汙泥中
1.4.2複合菌的優勢
在研究微生物對某種有機物的降解過程的時候，往往采用單菌落降解。但是 隨著各種冷卻劑、增塑劑、殺蟲劑和防腐劑等化學添加劑的廣泛應用，越來越多 合成的、有毒的、難降解的物質進入了環境當中。這些物質往往會對微生物的降 解表現出較強的抵抗作用，HPAM也是如此，主要原因可能是單一的微生物不具 備單獨降解這些難降解化合物的代謝能力[54]，而需要借助微生物或群落間的協 同作用。
董春娟等[54]研究認為微生物群落可以通過對難降解物質的協調利用、共代 謝和轉移中間產物等途徑達到對難降解物質的生物降解。在協調作用中，單菌種 不具備一整套完整的酶係統或基因成分來降解那些難降解的有機物，而微生物群 落中不同基因的擁有者卻可能發生基因交換或重組，從而導致新的降解途徑的實 現。對難降解物質，有些能在單純厭氧微生物作用下降解；有些需經厭氧水解提 高汙染物的生物可降解性，再被好氧微生物最終降解；而有些需在同一體係中經 曆一係列好氧、厭氧過程才能降解。聚丙烯酰胺降解菌的篩選及降解含聚丙烯酰胺汙水的室內研究,所以有必要對各種微生物生態係統、微生物 群落及其環境進一步研究。
佘躍惠等[52]將7株HPAM降解菌混合在一起，研究由他們組成的群落對 HPAM的降解情況和對含HPAM廢水的處理情況，探究了它們的降解機理。由於 配製培養基所用的HPAM為超高分子量的聚合物（分子量為1.6 xl〇6 )，一般說 來，它們不能直接透過細胞壁被微生物利用。所以這7株菌中，至少有一株是能
14
夠產生胞外酶的。通過胞外酶的作用，先對HPAM進行水解或者使其斷鏈而降 低分子量，從而可以被微生物進一步的降解。文獻中指出，混合菌可能具有協調 機製，從而提高了降解效果。微生物可能並不是以HPAM為碳源，但同樣可以引 起HPAM的降解，可能是微生物的群落效應，在存在合適底物的時候，群落中的 一些微生物會以這些底物為營養而生長，但其代謝產物或其代謝產生的某些酶會 間接的與HPAM發生相互作用，從而導致HPAM的水解或斷鏈，而這些產物又可 以被其他的微生物所利用，從而導致了 HPAM的降解[55]。但是具體的降解機理文 獻中並沒有指出，已查閱的其他相關文獻，也鮮有關於混合菌協同降解機理的研 究。
聚丙烯酰胺驅油的采出液中，不僅含有聚丙烯酰胺，而且還含有原油。如何 對這兩種成分同時進行有效分解，減少環境汙染帶來的壓力，是聚丙烯酰胺使用 者在聚丙烯酰胺驅油中非常關注的問題。目前篩選出的菌種大部分隻能單一的降 解原油或聚丙烯酰胺，所以急需解決的問題之一便是篩選出對原油和聚丙烯酰胺 都能高效降解的菌種。
1.4.3同時降解石油烴和聚丙烯酰胺的菌種
李蔚等[38]從大慶油田聚丙烯酰胺驅油采出液中篩選出了一株聚丙烯酰胺降 解菌，同時對原油有降解作用。廖廣誌等[51]從大慶油田各采油廠聚合物區塊篩 選優化出能在聚合物和原油存在的條件下生長繁殖的5株混合菌，對原油和聚丙 烯酰胺都有顯著降解作用。
由於聚丙烯酰胺的高分子量和高粘度的特性，能降解聚丙烯酰胺的菌種對原 油有一定程度的降解，而能降解原油的菌株經馴化或基因誘變後對聚丙烯酰胺可 能具有降解作用。我們可利用已知烴降解菌，經馴化或基因誘變後考察對聚丙烯 酰胺的降解作用，是研究者今後的一個研究方向。
1.5論文研究內容及實驗技術路線框圖
隨著聚合物驅油在我國的大麵積推廣與應用，含聚丙烯酰胺汙水的數量在逐 年增加，這使得含聚合物汙水的處理研究已經迫在眉睫，其中最核心的問題便是 HPAM的降解。傳統的氧化方法的缺陷和光催化技術的不成熟以及微生物本身的
15
特殊優勢將使微生物降解成為解決聚丙烯酰胺引起的環境問題的有效手段。目 前，微生物降解HPAM研究已經取得了一些成果，但研究仍處於初步階段。本論 文將以下幾方麵進行進一步探索：
(1)尋找篩選高效降解聚丙烯酰胺的菌種，並對其降解進行深入研究。
(2)複合菌因可能具有協調機製，具有較高降解效果，篩選高效複合菌以 及研究其降解機理是本論文探索的一個方向。
(3)由於油田含聚汙水為原油和聚丙烯酰胺的混合體係，考察菌種同時對 聚丙烯酰胺和原油的降解效果是本論文探索的又一個方向。
16
實驗技術路線框圖:
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2聚丙烯酰胺的性質考察及評價方法優化
部分水解聚丙烯酰胺（HPAM)目前被廣泛應用於油田三次采油中，利用 HPAM作為聚合物驅對提高石油采收率的效果明顯，已成為是中後期油田生產中 至關重要的一環[58]。研究影響HPAM溶液穩定性的因素，對充分掌握該聚合物的 性質尤為重要，也是考察聚丙烯酰胺降解的重要參考依據。
2.1聚丙烯酰胺理化性質的測定
聚丙烯酰胺在空氣中容易吸潮，通過在幹燥箱中烘幹，除去所吸水分，從而 評價其幹重。水解度的測定是使用甲基橙-靛藍二磺酸鈉為指示劑，用鹽酸標準 溶液滴定。分子量的測定是使用烏氏粘度計測定其粘均分子量。使用布式粘度計 測定其動力粘度，用烏氏粘度計測定其運動粘度。使用澱粉-碘化鎘光度法對聚 丙烯酰胺的濃度進行了測定。
2.1.1儀器與試劑
2.1.1.1主要試劑
聚丙烯酰胺（山東東營市長安聚合物集團公司）
冰醋酸（A.R，500 mL)，天津廣成化學試劑有限公司 Ab(SO4)3.18H2〇 (A.R，500 g)，天津博迪化工有限公司 Cdl2 (A.R，500 g)，上海試劑二廠 甲酸鈉（A.R，500 g)，天津市科密歐化學試劑有限公司 可溶性澱粉（A.R，500 g)，天津巴斯夫化工有限公司 溴水（A.R，500 mL)，天津大茂化學試劑廠 鹽酸（A.R，500 mL)，天津市耀華化學試劑有限公司 甲基橙（A.R，25 g)，天津市瑞金特化學品有限公司 靛藍二磺酸鈉（A.R，25 g)，天津市博迪化工有限公司 2.1.1.2主要儀器
BP221 Sartorius萬分之一電子分析天平日本島津
18
上海山連實驗設備有限公司 成都儀器廠 成都儀器廠 北京儀器廠 上海第三儀器廠
DHG-9053電熱鼓風幹燥箱
HSS-1數字超級恒溫水浴槽 NDJ-99旋轉粘度計 烏氏粘度計（內徑0.58 mm) 721型分光光度計
另有：幹燥器、稱量瓶、酸式滴定管、250 mL錐形瓶、50 mL比色管、移 液管（1ml、5 ml、10 ml、15 ml、25 ml)各若幹。
2.1.2實驗方法
2.1.2.1聚丙烯酰胺固含量的測定方法
將精確稱重的聚丙烯酰胺樣品放入預先稱重的稱量瓶中，然後將其放入105 ±1°C的幹燥箱中，幹燥90min後取出，放入幹燥器中冷卻稱重。
固含量：S=(Z-X)/(Y-X) X100%(2-1)
式中：S固含量，°%; X稱量瓶重，g; Y稱量瓶與濕樣重，g;
Z稱量瓶與幹樣重，g
2.1.2.2聚丙烯酰胺水解度的測定方法
先將聚合物樣品溶於蒸餾水中，使其濃度為1000 mg/L。用移液管移取10.00 mL已溶解好聚合物溶液於250 mL錐形瓶中，加10 mL蒸饋水，攪拌均勻。再向 錐形瓶中加2滴甲基橙指示液、2滴靛藍二磺酸鈉指示液，搖動均勻，此時溶液 呈黃綠色。用0.1000 mol/L鹽酸標準溶液滴定。溶液由黃綠色變為淺灰色即為終 點（如變成紫色，則表示滴過終點）。平行測定相對誤差小於±0.5 %[59]。
水解度：A=71 MV/(1000WS-23MV) X100%(2-2)
式中：A水解度，％; M鹽酸標準溶液的摩爾濃度，mol/L; V消耗
的鹽酸體積，mL; W——聚合物樣品的質量，g。S——聚丙烯酰胺的固含量， %。
2.1.2.3聚丙烯酰胺粘均分子量的測定方法 測定步驟如下[60]:
(1)先用洗液將粘度計洗淨，再用自來水、蒸餾水分別衝洗幾次，每次都要注意 反複衝洗毛細管部分，洗好後烘幹備用。
19
(2)調節恒溫槽溫度至(30.0±0.1) °C，在粘度計的B管和C管上都套上橡皮管， 然後將其垂直放入恒溫槽，使水麵完全浸沒1球。
(3)用移液管分別吸取已知濃度的聚丙烯酰胺溶液10 mL和NaN〇3溶液(3 mol.L-1)5 mL，由A管注入粘度計中，在C管處用洗耳球打氣，使溶液混合均勻， 濃度記為G，恒溫10 min，進行測定。測定方法如下：將C管用夾子夾緊使之不 通氣，在B管用洗耳球將溶液從4球經3球、毛細管、2球抽至1球2/3處，解 去夾子，讓C管通大氣，此時3球內的溶液即回入4球，使毛細管以上的液體懸 空。毛細管以上的液體下落，當液麵流經a刻度時，立即按停表開始記時間，當 液麵降至b刻度時，再按停表，測得刻度a、b之間的液體流經毛細管所需時間。
重複這一操作至少三次，它們間相差不大於0.3 s，取三次的平均值為〇。
(4)然後依次由A管用移液管加入5 mL、5 mL、10 mL、15 mLNaN〇3溶液(1
mol-L-1)，將溶液稀釋，使溶液濃度分別為C2、G、〇、G，用同法測定每份溶 液流經毛細管的時間^、^、0、、5。應注意每次加入NaN〇3溶液後，要充分混合 均勻，並抽洗粘度計的E球和G球，使粘度計內溶液各處的濃度相等。
(5)溶劑流出時間的測定。用蒸餾水洗淨粘度計，尤其要反複流洗粘度計的毛細 管部分。用1 mol.L-1NaN〇3洗1〜2次，然後由A管加入約15 mL1 mol.L-1NaN〇3 溶液。用同法測定溶劑流出的時間t。。
t
n t0
(2-3)
式中，t為溶液的流出時間，t0為純溶劑的流出時間。所以通過溶劑和溶液 在毛細管中的流出時間，從(1-6)式求得"r，再由圖1-1求得["]
n] = KM(2-4)
30 °C聚丙烯酰胺的K=37.3x10-6，a=0.66。由此求出粘均分子量M。
20
烏貝路德粘度計
外推法求[n]
圖2-1烏氏粘度計測定原理
Fig. 2-1.Determination principles of Ubbelohde viscometer
2.1.2.4聚丙烯酰胺粘度的測定方法
a)運動粘度
運動粘度（kinetic viscosity，Vk)用烏氏粘度計測得。
Vk=Ct(2-5)
Vk,單位為mm2-s-1; C為粘度計常數，本實驗為0.01036 mm2-s-2; t為流出時間。
具體操作步驟同分子量的測定。
b)動力粘度
旋轉粘度計工作原理，由同軸的轉子與外筒（可用內徑不小於8.5 cm的燒 杯代替）共同組成測量流體粘度的傳感係統，當轉子以某一轉速旋轉時，因外筒 固定不動，流體受到剪切而產生粘滯力，此力作用於轉子表麵而使轉子受到粘滯 力矩，從而使測量遊絲偏轉一相應角度，流體粘度越大，該粘滯力矩也越大，偏 轉角也越大。檢測此平衡力矩，便可測得該流體的動力粘度值。
儀器的平衡力矩由精密遊絲提供，設在平衡力矩作用下轉子產生角位移所需時間 為t，則被測流體動力粘度（dynamic viscosity，Vd)可由下式描述：
Vd=KXt(2-6)
式中：K為儀器係數，由遊絲剛度，轉子結構係數及轉速所決定。
動力粘度用旋轉粘度計（1號轉子，30rmin-1)測得，單位為Pa-s。
21
2.1.3實驗結果與討論 2.1.3.1聚丙烯酰胺固含量的測定
由於聚丙烯酰胺極易吸收空氣中的水分，為保證實驗結果的準確度，需測定 聚丙烯酰胺樣品中純聚丙烯酰胺的含量。稱取一係列不同質量的固體樣品，測定 了不同質量固體中的聚丙烯酰胺的含量，如表2-1:
表2-1不同質量固體樣品中的純聚丙烯酰胺的含量 Table 2-1 The solid content of HPAM samples
原樣的質量（g)0.10560.20170.49780.80441.026
烘幹後的質量（g)0.10400.19660.48610.77990.9985
固體含量（％)98.5497.4797.6596.9597.32
平均含量（°%)97.59
實驗測得聚丙烯酰胺固含量為97.59 °%
2.1.3.2聚丙烯酰胺水解度的測定
測定其水解度對了解聚丙烯酰胺溶液的性質尤為重要。本實驗使用的滴定管 為1 mL微量滴定管，最小刻度0.01 mL
表2-2測定的聚丙烯酰胺的水解度值 Table 2-2 The hydrolyzation degree of HPAM
消耗鹽酸體積0.300.300.31
水解度（°%)232324
平均值（°%)23.3
實驗測得的聚丙烯酰胺的水解度為23.3 %。
2.1.3.3聚丙烯酰胺分子量的測定
原始溶液濃度為200 mg*L-1；恒溫溫度30.00 °C
22
3/fI0/&II
00.050.10. 15
濃度/mol-L-1
圖 2 -2 nsp/C—C 及 lnnr/C—C 圖
Fig.2-2 The value of nsp/C—C and ln^r/C—C
由上圖可得["]=2.219。
由公式(2-6)計算得聚丙烯酰胺的粘均分子摩爾質量M=1.71x107 g.mol-1。 2.1.3.4聚丙烯酰胺粘度的測定
測定了不同濃度的聚丙烯酰胺的動力粘度和運動粘度。結果如表2-3
表2-3不同濃度的聚丙烯酰胺的動力粘度和運動粘度
Table 2-3 The dynamic viscosity and kinetic viscosity of HPAM
濃度（mg/L)100200300400500
動力粘度Vd (mPa_s)21426588102
流出時間（s)230.01381.54562.88745.27967.33
運動粘度Vk (mm2/s)2.383.955.847.7210.02
如表2-3所示測定聚丙烯酰胺的動力粘度和運動粘度的變化趨勢是吻合的，聚丙烯酰胺降解菌的篩選及降解含聚丙烯酰胺汙水的室內研究, 都隨聚丙烯酰胺的濃度增大而增大。
2.2聚丙烯酰胺降解影響因素探討
本文考察了在實驗室條件下，外界因素（光照、溫度、pH值、機械剪切、 無機鹽等）對聚丙烯酰胺穩定性的影響。由於聚丙烯酰胺是高分子量的聚合物， 單一的評價指標很難對其降解進行準確評價，因此，本文采用多種評價指標（濃 度、動力粘度、運動粘度）對其降解進行較為全麵的衡量。
23
2.2.1主要儀器與試劑
2.2.1.1聚丙烯酰胺樣品及主要試劑 同 2.1.1。
2.2.1.2主要儀器及設備
江蘇太倉市實驗設備廠 成都儀器廠 上海申安醫療器械廠 Nicolet, USA 上海第三分析儀器廠 HANNA instrument, USA 北京儀器廠 成都儀器廠
長沙湘儀離心機儀器有限公司
DSHZ-300水浴恒溫振蕩器 HSS-1數字超級恒溫水浴槽 LDZX-50FAS壓力蒸汽滅菌鍋 AVATER 360FT-IR型紅外光譜儀 721型分光光度計 pH計
烏氏粘度計（內徑0.58mm) NDJ-99旋轉粘度計 TG16-WS台式高速離心機
2.2.2實驗內容與方法 2.2.2.1聚丙烯酰胺濃度評價
聚丙烯酰胺的濃度測定采用油田常用的澱粉-碘化鎘法（大港石油管理局企 業標準——聚合物驅油劑室內評價方法，Q/DG1170-88)。濃度直接表示為吸光 度（absorbance，A)。
澱粉-碘化鎘方法的原理是利用聚丙烯酰胺與溴反應，生成N-溴代聚丙烯酰 胺，剩餘的溴用甲酸納來還原，而N-溴代聚丙烯酰胺發生水解，放出次溴酸，加 入澱粉-碘化鎘溶液，次溴酸氧化碘離子成碘，而碘與碘離子以及澱粉生成絡合 物顯藍色。其顏色的深淺與聚合物的濃度成正比，用分光光度計測定其吸光度， 便可知相應的聚合物的濃度。反應方程式如下所示[61]:
OO
+ HBr
(2-8)
II^ cII
R—C—NH2 +Br2 ► R—C —NHBr
CO2
(2-9)
Br2+ HCOONa ► NaBr + HBr +
24
O
O
R—C—NHBr +H2O —-R—C—NH2 + HBrO(2-10)
HBrO + 2I-+ H+—► I2 + Br- + H2O(2-11)
測定步驟如下：
(1)用去離子水準確配製500 mg.L-1的聚丙烯酰胺溶液1 L。
(2)將配製好的500 mg_L-1的聚丙烯酰胺溶液用蒸餾水分別配製成50、100、150、
200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚合物溶液各 50 mL。
(3)加5 mL pH3.5的醋酸緩衝溶液於11個50 mL的比色管中（1個空白參比）。 ⑷加入1mL個濃度的聚合物溶液、25-30 mL蒸餾水。
(5)加入1 mL飽和溴水，反應15 min。
(6)加入5 mL甲酸鈉，等溶液褪色後再上下搖動，反應5 min,至顏色完全褪
去。
(7)加入5 mL澱粉-碘化鎘溶液，並加入蒸餾水至刻度，搖勻。
(8)顯色18 min後，在分光光度計上以585 nm的波測定溶液的吸光度，用空 白樣作參比。
2.2.2.2聚丙烯酰胺粘度評價 評價方法同2.1.2.4。
2.2.3實驗結果及討論
2.2.3.1聚丙烯酰胺自然降解
將300 mg.L-1的聚丙烯酰胺溶液在避光放置，測定其濃度、運動粘度、動力 粘度隨時間的變化。
25
sre-_0I/-"s8-A-mmI^Q
3°ureqJ0sqY
—■—Absorbance —◄ — Kynamic viscosity —Kinetic viscosity
一-Xmu/^SS-A-P-3^
0.05.0
0510152025
Time/day
圖2-3聚丙烯酰胺自然放置的變化 Fig.2-3 The nature change of HPAM
由圖2-3可以看出在三周之內聚丙烯酰胺的運動粘度、動力粘度變化不大， 說明其粘度具有較大的穩定性。而其濃度下降較大，主要是由於其在溶液中酰胺 基水解造成測定濃度降低。而其粘度在前五天內有先升高後下降的趨勢，主要原 因是聚丙烯酰胺由於其高的分子量在溶液中不能立即溶解完全，還有一個相應的 溶脹期，三天左右溶解完全。
2.2.3.2溫度的影響
將300 mg.L-1聚丙烯酰胺溶液在4、20、30、40、50和70 °C水浴環境避光
放置下，過4天、11天後測定各指標。
26
0.6-
•^d'OI/^-sou-A-mml^0 8lmqJ0sqy
■5
0-
■4
0-
3
0-
■2
0-
—Absorbance(after 11 days)
—A— Dynamic viscosity(after 4 days) —A— Dynamic viscosity(after 11 days)
—Kinetic viscosity(after 4 days)
—Kinetic viscosity(after 11 days)
i1 i• i1 i• i• i• i' i~
010203040506070
Temperature/°C
'-•O,mm/Aj-00S--H>-PS^
5 0 5 0 5
5-5-4-4-3-
圖2-4溫度對聚丙烯酰胺的影響 Fig.2-4 The effect of temperature on stability of HPAM 由圖2-4可以看出聚丙烯酰胺在較低溫度時，具有較高的熱穩定性。即使在 70 °C溫度下放置11天，其動力粘度隻下降了 14 %，運動粘度下降了 12%，吸 光度（即濃度）下降了 14.5%。而在高溫下，則會降解明顯。300 mg.L-1聚丙烯 酰胺溶液在121 C高溫維持1個小時，其動力粘度由0.065 Pa_s降低為0.052 Pa-s， 下降了 20 %。；運動粘度由5.80 mm2.s-1降低為4.66 mm2.s-1，下降了 20%。，吸光度 由0.538下降為0.405下降了 25 %。
2.2.3.3pH值的影響
配製300 mg-L-1的聚丙烯酰胺溶液，用1 mol-L-1的鹽酸和1 mol-L-1NaoH溶液
調節其pH值由3-10變化，在此過程中測定其粘度與濃度的變化。實驗結果如圖 2-5所示：
27
—Absorbence
圖2-5 pH值對聚丙烯酰胺的影響 Fig. 2-5 The effect of pH on stability of HPAM
由圖2-5可以看出pH值對聚丙烯酰胺粘度的影響很大。300 mg.L-1聚丙烯酰 胺溶液的初始pH值為7.0-7.2。當將溶液pH值調向酸性時其粘度迅速降低，當pH 值為3時其動力粘度由0.065 Pa-s降低為0.011 Pa-s，下降了 83 °%；運動粘度由 5.83 mm2-s-1降低為1.17 mm2-s-1，下降了 80°%。其原因是H+使酰胺基質子化，使
聚合物的羧基離子的電斥力受到抑製，分子線團發生卷曲，表觀尺度減小，從而 使粘度降低[57]。當pH值調向堿性時，其粘度基本無變化，主要原因是雖然堿性 可促進酰胺基水解，但對主鏈影響不大，所以對粘度影響不大。在酸性時對聚丙 烯酰胺濃度無影響，在堿性時由於酰胺基水解使測得的濃度有所降低。
由於測定的聚丙烯酰胺動力粘度與運動粘度的變化一致，以下實驗均以測定 其動力粘度代表其粘度的變化。
2.2.3.4光照的影響
配製兩組標準係列（濃度為100、200、300、400和500 mg.L-1)。一組暴露
在自然光下，一組放在陰暗處避光。經過11天、21天的放置，用澱粉一碘化鎘 法測定其吸光度（圖2-6a)。再配製兩組150 mg_L-1和300 mg_L-1的聚丙烯酰胺溶 液，一組光照，一組避光。經過一定時間後，測其動力粘度變化（圖2-6b)
28
ssqjosqv
-lighting(lldays)
°-1I1I1I1I1I
100200300 i400500
Concentratlon/mg-L
a)光照對濃度的影響/The effct of light on concentration of HPAM
b)光照對粘度的影響The effct of light on viscosity of HPAM 圖2-6光照對聚丙烯酰胺的影響 Fig. 2-6 The effct of light on stability of HPAM 由圖2-6a、圖2-6b光照組與不光照組對比可以看出，光照組與不光照組相 對粘度隨時間有很大變化，而相對濃度沒有明顯變化。HPAM的光致降解可以用 鍵能的大小來解釋：HPAM中C-C、C-H、C-N鍵的鍵能分別為340、420和414 kJ-mol-1，因此相應地要斷裂這些鍵所對應的波長分別為325、250和288 nm。 但由於臭氧層的存在,吸收了 286-300 nm的全部輻射，因此太陽輻射隻能使C-C 鍵斷裂，而對C-H和C-N鍵影響很小。這與Smith等[62]的研究結果一致。
29
2.2.3.5機械剪切的影響
配製了幾組同一濃度係列的聚丙烯酰胺溶液，考察了普通過濾、濾膜減壓過 濾、離心、振蕩器剪切對聚丙烯酰胺的影響，測定了其濃度、動力粘度的變化。 普通過濾使用定性濾紙；濾膜減壓過濾使用的濾膜為0.45 pm；離心機設定條件 為：轉速9000 r.min-1，離心20 min;振蕩器剪切設定的條件為：轉速120 rmin-1, 室溫下搖動3天。測定結果如圖2-7.
-■— Original sample,Vd -★— Filtration,Vd —▲— Vacuum filtration，Vd -▼— Centrifugation,Vd
—□— Original sample,A —☆— Filtration,A —麽一Vacuum filtration, A —▽— Centrifugation,A —〇— Shaker-shear,A
100
200
300
400
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.20-.
0.18¬
0.16¬
0.14¬
0.12¬
0.10¬
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
500
Concentration / mgL
圖2-7機械剪切對聚丙烯酰胺的影響 Fig. 2-7 The effect of mechanical shear on stability of HPAM
由圖2-7可以看出短時間的機械剪切（除濾膜減壓過濾外）對聚丙烯酰胺的 濃度與粘度影響均不大，而長時間的振蕩器剪切對其濃度和粘度都有較大影響， 且影響隨著聚丙烯酰胺溶液的濃度增大而增大。濾膜減壓過濾對其粘度有較大影 響，原因可能是在透過濾膜時，由於濾膜孔徑很小（0.45 pm)，將聚丙烯酰胺的 長分子鏈剪切使其變為較短的分子鏈，粘度大幅度下降；由於酰胺基基本不受影 響，所以在此過程中聚丙烯酰胺的濃度變化不大。
2.2.3.6無機鹽的影響
考察了陽離子對聚丙烯酰胺粘度和濃度的影響。一價離子以Na+為代表，二 價離子以Mg2+為代表，三價離子以Al3+為代表。實驗結果表明少量的Al3+便可使 聚丙烯酰胺變成凝膠乃至沉澱。下圖中列出的僅為Na+、Mg2+以及二者共同添
30
加（WNaCl:WMgC12=l:l)時對聚丙烯酰胺的影響。
圖2-8礦化度對聚丙烯酰胺的影響 Fig. 2-8 The effect of minerlization on stability of HPAM
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 ,
Xfl
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
由圖2-8可以看出加入一價、二價陽離子都會使聚合物大分子線團收縮，溶 液粘度降低，二價離子比一價離子下降的更多。Na鹽、Mg鹽的混合鹽所引起的 粘度比單獨使用等量的Mg鹽下降的更大一些，這是由於離子協同作用所致[63]。 由金屬離子和羧基的締合作用，使得聚合物大分子鏈收縮成線團，所以開始時加 入少量的金屬離子就可使聚合物的粘度降低很多。當金屬離子加入一定濃度以 後，繼續投加時，粘度降低速度逐漸平穩，主要是因為金屬離子已經不能進入分 子線團內，而是在分子線團外圍凝結，並且由於線團之間的相互作用，使得彼此 的分子尺寸略有變小，粘度減小比開始時緩慢[63]。但無機鹽對於聚丙烯酰胺的 濃度影響不大。
2.3評價方法優化
在對聚丙烯酰胺的理化性質和降解影響因素考察的基礎上，根據現有的對聚 丙烯酰胺體係的評價方法，優化出在生物降解體係中適用的評價方法。
31
2.3.1主要儀器與試劑 同 2.1.1
2.3.2實驗內容與方法 同 2.2.2
2.3.3實驗結果及討論 2.3.3.1聚丙烯酰胺的評價方法
依據聚丙烯酰胺的高分子量及其水溶液的高粘度的特點，對其的評價方法主 要是從粘度、濃度、分子量三方麵去評價。三種評價方法中，由於聚丙烯酰胺的 粘度受到的影響因素很多（詳見2.2聚丙烯酰胺降解影響因素探討)，在本論文 中的對生物降解的評價中，特別是培養基中無機離子的存在使其粘度降低很大； 而用聚丙烯酰胺分子量的評價是建立在粘度基礎上的粘均分子量，同樣受到的影 響因素很多；而濃度的評價方法受到環境的影響因素較少，所以本實驗中以濃度 評價聚丙烯酰胺降解為主，粘度和分子量評價為輔。
2.3.3.2聚丙烯酰胺濃度測定方法
聚丙烯酰胺濃度的測定方法有很多，聚丙烯酰胺降解菌的篩選及降解含聚丙烯酰胺汙水的室內研究,文獻中使用的方法有澱粉-碘化鎘法、 濁度法、熒光分光光度法、高效分子排阻色譜法、凝膠色譜法、放射性同位素標 記法、有機碳含量法、量熱法、UV/可見光光譜法、沉澱法等[64]。其中最常用、 簡單快捷、重現性好的方法是澱粉-碘化鎘法和濁度法。
本實驗采用澱粉-碘化鎘法測定聚丙烯酰胺的濃度。濁度法的原理是聚丙烯 酰胺在酸性條件下與次氯酸鈉發生霍夫曼重排反應，生成不溶於水的胺類化合 物，其濁度值與聚丙烯酰胺濃度成正比[65]。由於本實驗主要考察聚丙烯酰胺的 生物降解，培養基在培養一段時間之後，由於微生物的生長代謝培養基本身就有 很大的濁度。且濁度法使用的氧化劑——次氯酸鈉濃度較大（13.1 g.L-1，15 mL)， 反應時間較長（30 min)，副反應較多，所以會影響測定結果的準確性。而澱粉 碘化鎘法在一定程度上可以避免，其反應時間較短（15 min)，用量較少（3.0%， 1mL)，且多餘的溴水會被甲酸鈉還原，最大限度地減少了副反應。
2.3.3.3澱粉-碘化鎘法測定條件的優化
32
現有的文獻中對於澱粉-碘化鎘法的研究較多，並有較為成熟的測定條件。 但是對於其測定的醋酸緩衝溶液的最佳pH值卻存在爭議。大港油田管理局企業 標準（Q/DG1170-88)中緩衝溶液的最佳pH值為3.5，而關淑霞[66]等研究表明緩 衝溶液的最佳pH值為5.0。為確定緩衝溶液的最佳pH值，本論文測定了在緩衝 溶液的pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的條件下用澱粉碘化鎘法測定了 0-500mg.L-1—係列不同濃度聚丙烯酰胺的吸光度值（圖2-9)。
圖2-9不同pH值醋酸緩衝溶液條件下測得的聚丙烯酰胺濃度標準曲線 Fig. 2-9 The concertration standard line of HPAM under different pH value of suffer
solution conditions
實驗結果表明醋酸緩衝溶液pH為3.5時，測得的聚丙烯酰胺標準曲線線性最 好，其相關係數R2=0.9964，y=0.00154x+0.02557。
由圖2-9還可以看出隨著醋酸緩衝溶液pH值的增大，用澱粉-碘化鎘法測得 的同一濃度的聚丙烯酰胺溶液的吸光度逐漸降低。這是由於氧化劑次溴酸在pH 增大的條件下越來越不穩定存在，影響了對聚丙烯酰胺酰胺基的氧化，所以測得 的吸光度逐漸降低。但是緩衝溶液的pH值降低在增大次溴酸的穩定性的同時也 使氧化的副反應增多，所以緩衝溶液的pH值也不能太低，本實驗選擇醋酸緩衝 溶液最佳pH為3.5。
33
2.4本章小結
1)對本論文所用的聚丙烯酰胺的理化性質進行了測定。聚丙烯酰胺的固含 量為97.59 %，水解度為23.3 %，粘均分子量為1.71X107。
2)對聚丙烯酰胺降解影響因素進行了探討。pH值、光照和礦化度對聚丙 烯酰胺的粘度影響較大，而對於聚丙烯酰胺的濃度影響較小。低溫和弱的機械剪 切對聚丙烯酰胺的粘度和濃度影響都不大，而高溫和強的機械剪切對聚丙烯酰胺 的粘度和濃度影響都比較大。
3)對聚丙烯酰胺的評價方法進行了優化，以濃度評價聚丙烯酰胺降解為主， 粘度和分子量評價為輔；在濃度評價方法中采用澱粉-碘化鎘法，並對其測定條 件中的緩衝溶液的pH值進行了優化，測定的緩衝溶液的最佳pH值為3.5。
34
3聚丙烯酰胺降解菌的篩選及性能評價
3.1菌株的篩選及鑒定
3.1.1實驗材料與儀器
3.1.1.1菌種來源
菌種來自勝利油田采出水。
3.1.1.2主要試劑
溶菌酶，：Fluka 62970，北京欣經科生物技術有限公司
蛋白酶K，Roche 109126，北京欣經科生物技術有限公司
RNaseA，Merck，北京欣經科生物技術有限公司
三（羥甲基）胺基甲烷（Tris)，分析純，國藥集團化學試劑有限公司
十六烷基三甲基溴化胺（CTAB)，分析純，天津科密歐化學試劑開發中心
十二烷基硫酸鈉（SDS)，分析純，天津科密歐化學試劑開發中心
聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP)，SigmaP-6755分裝，北京欣經科生物技術有限
公司
Tris 飽和酚，H&YBio.Co.Ltd，Tianjin，China.
溴化乙錠（EB)、TAKARA上樣緩衝液，ABI，USA TAKARA 2500DNA 分子量標準，ABI，USA
其它試劑：氯化鈉、乙酸鈉、EDTA、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇等，均 為分析純。
3.1.1.3主要儀器及設備
江蘇太倉市實驗設備廠 上海山連實驗設備有限公司 北京亞泰科隆實驗科技開發中心 上海申安醫療器械廠 上海第三分析儀器廠 HANNA instrument, USA
35
DSHZ-300水浴恒溫振蕩器 SHP-150生化培養箱 YT-CJ-IND淨化工作台 LDZX-50FAS壓力蒸汽滅菌鍋 721型分光光度計 pH計
TGL-16G台式高速離心機上海醫用分析儀器廠
Eppendorf 微量移液器Germany
3.1.1.4培養基
選擇性液體培養基（g.L-1):聚丙烯酰胺0.3，酵母浸粉0.05, KH2PO4 1.0， MgS〇4.7H2〇 0.2，NaCl 0.5，pH值 7.0。
選擇性固體培養基：向上述培養基中加入15〜20g/L的瓊脂粉，製成平板。 富集培養基（g-L-1):牛肉浸膏3.0，蛋白腖10.0, NaCl 5。
3.1.2實驗方法
3.1.2.1菌種的篩選
分別取油田采出水接種到裝有選擇性液體培養基的錐形瓶中，放入溫度為 37 °C、轉速為140rmin-1的恒溫水浴振蕩器中培養數天，然後在平板上劃線，並 在37 °C的生化培養箱中培養。
選擇生長良好的菌株作為實驗菌株，擴大培養和馴化，然後借助形態學觀察 和生理生化實驗進行鑒定。
3.1.2.2菌種的常規的生理生化性質測定
本實驗參照《簡明第八版伯傑細菌鑒定手冊》[68]、《常見細菌係統鑒定手冊》 [69]對篩選的細菌進行生理生化性質測定，將細菌初步鑒定到屬。鑒定方法主要 有革蘭氏染色法、芽孢染色法、V-P實驗、葡萄糖氧化發酵實驗、澱粉水解試驗、 甲基紅試驗、接觸酶試驗、明膠液化、半固體瓊脂穿刺、細菌的運動性觀察、硫 化氫反應等。
(1)革蘭氏染色：挑取少量菌苔塗布在載玻片上，風幹，在火焰上固定塗 片，滴加結晶紫染色1-2 min，水洗，滴加碘液衝去殘水，並用碘液覆蓋約1 min， 水洗。用濾紙吸去載玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用95 %的乙 醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗。用番紅液複染約2 min，水洗。 幹燥後，用油鏡觀察。菌體被染成藍紫色的為革蘭氏陽性菌，被染成紅色的為革 蘭氏陰性菌。
(2) 芽孢染色：加1-2滴水於小試管中，用接種環挑取2-3環菌苔於試管 中，攪拌均勻，製成濃的菌懸液。加孔雀綠染液2-3滴於小試管中，並使其與菌
36
液混合均勻，然後將試管置於沸水浴的燒杯中，加熱染色15-20 min。用接種環 挑取試管底部菌液數環於潔淨載玻片上，塗成薄膜，然後將塗片通過火焰3次溫 熱固定。水洗，直至流出的水無綠色為止。用番紅染液染色2-3 min，傾去染液 並用濾紙吸幹殘液。幹燥後用油鏡觀察。芽孢呈綠色，芽孢囊及營養體為紅色。
(3)接觸酶實驗
將24 h培養的斜麵接種，以玻璃棒沾取少許塗在3 %過氧化氫的玻片上，如 有氣泡產生則為陽性，無氣泡為陰性。
(4)甲基紅實驗
培養基：蛋白腖，5 g.L-1;葡萄糖，5 g.L-1; K2HPO4，5 g.L-1。在培養液中
加入一滴甲基紅試劑，紅色為甲基紅試驗陽性反應，黃色為陰性反應。
(5)V-P試驗
培養基同甲基紅試驗。取培養液和40 %氫氧化鈉等量相混。加少許肌酸， 10 min如培養液出現紅色，即為試驗陽性反應。
(6)澱粉水解
在肉汁腖中加0.2 %可溶性澱粉，製成平板。培養2-5天，形成明顯菌落後， 在平板上滴加碘液平板呈藍黑色，菌落周圍如有不變色透明圈，表示澱粉水解陽 性，仍是藍黑色為陰性。
(7)纖維素水解
培養基：蛋白腖，5 g.L-1; NaCl，5 g.L-1。將培養基分裝試管，在培養基中
浸泡一條優質濾紙，能將濾紙條分解成一團纖維或將紙條折斷或變薄者為陽性， 無變化者為陰性。
(8)明膠液化
培養基：蛋白腖，5 g.L-1;明膠，100-150 g.L-1。分裝試管，取18-24 h的斜
麵培養物穿刺接種，做空白，於20 °C溫箱中培養，在20 °C以下的室溫觀察明膠 是否液化，如菌已生長，明膠表麵無凹陷且為穩定的凝塊，則為明膠水解陰性。 如明膠凝塊部分或全部在20 C以下為可流動的液體，則為明膠水解陽性。 3.1.2.3基因組DNA的提取、純化及測序
⑴細胞收集：取5 ml菌液在高速離心機上以9000 rmin-1速度離心10-15 min，
形成菌體細胞沉澱物，緩吸及清除上清液。
37
(2)裂解細胞:將離心所得菌體沉澱移入到2 mL緩衝溶液中(其組成為0.1 mol-L-1 磷酸鹽、0.1 mol-L-1Tris、0.01mol-L-1 EDTA、1.0 mol-L-1 NaCl和 1.0 %CATB, pH值為8.0)，加入600 0的10 %SDS溶液和60 pl的蛋白酶K(20mg-ml-1 )，並
輕微混勻，直到細胞處於懸浮狀態。然後將細胞的懸浮液在80 °C水浴中放 官30 min之後在室溫冷卻。
(3) RNase處理：在細胞裂解液中加入3 pL的RNase A,反複顛倒混勻溶液，在 3 7 C溫度中放置30-60 min,以去除DNA樣品中的RNA。
(4) 除蛋白：加入700 pL酚：氯仿：異戊醇(體積比為25: 24: 1)，混合均勻，
在12000 rmin-1下離心10 min,分離出上清液至新的離心管中。重複此步驟
3次。
(5)DNA抽提：在上一步所得的含有DNA的上清液中加入600 pl的純異丙醇， 劇烈振蕩混合溶液。用13000-16000 rmin-1速率離心10 min,倒掉上清液， 再加入70 %乙醇600 pL並充分混合，再用15000 rmin-1速率離心1 min，吸 出上清液，將離心管倒置於紙巾上涼幹。用50pL緩衝溶液(10 mmol_L-1Tris， pH值為8.0)溶解沉澱物即為DNA粗提液，並置於-20 °C貯存。
(6)DNA純化：使用北京天為時代生物技術公司的DNA純化試劑盒，按照操作 說明進行DNA粗提液的純化。
(7) 將純化的DNA送至天根生化科技（北京）有限公司測序。
3.1.2.4係統發育樹構建
將16S rDNA序列上傳至美國基因數據庫(GenBank)獲得GenBank登記號，
與基因數據庫比對，對獲得的同源序列進行序列分析。用用ClustalW軟件按照 最大同源性原則進行多重序列比對，將比對結果導入Mega 4.0軟件鄰位連接法 (Neighbour-Joining，NJ)和最大簡約性法(Maximum Parsimony methods，MP)建
立條帶序列係統進化樹。
注：構建進化樹的算法主要分為兩類：獨立兀素法(discrete character methods) 和距離依靠法(distance methods)。所謂獨立元素法是指進化樹的拓撲形狀是由序 列上的每個堿基/氨基酸的狀態決定的(例如：一個序列上可能包含很多的酶切位 點，而每個酶切位點的存在與否是由幾個堿基的狀態決定的，也就是說一個序列 堿基的狀態決定著它的酶切位點狀態，當多個序列進行進化樹分析時，進化樹的
38
拓撲形狀也就由這些堿基的狀態決定了 )。而距離依靠法是指進化樹的拓撲形狀 由兩兩序列的進化距離決定的，進化樹枝條的長度代表著進化距離。獨立元素法 包括最大簡約性法(Maximum Parsimony methods)和最大可能性法(Maximum Likelihoodmethods)，距離依靠法包括除權配對法(UPGMAM)和鄰位相連法 (Neighbor-joining)[69]。
3.1.3實驗結果及討論
3.1.3.1篩選結果
初步篩選到三株好氧的聚丙烯酰胺降解菌。分別命名為PM-2、PM-3、PM-4。
菌落照片 / The colony photo革蘭氏染色照片/The Gram's stain photo
a) PM-2
菌落照片/ The colony photo革蘭氏染色照片/The Gram's stain photo
b) PM-3
39
菌落照片 / The colony photo革蘭氏染色照片/The Gram's stain photo
c)PM-3
圖3-1菌株的菌落和革蘭氏染色照片 Fig. 3-1 The colony and gram staining potos of the three strains
3.3.3.2菌株的生理生化性質
表3-1菌體的表麵形態特征和生理生化特征
Table 3-1 Characterization of the strains
鑒定特征PM-2PM-3PM-4
菌落顏色白色淡黃色乳白色
是否透明不透明不透明半透明
菌落表麵不光滑、幹燥光滑、幹燥光滑、濕潤
菌落邊緣形 態
菌體形態規則，有暈環 杆狀規則，有暈 環
杆狀規則，無暈 環
短杆狀
革蘭氏染色++-
芽孢染色++-
接觸酶+--
甲基紅試驗+++
V-P試驗+--
明膠液化+++
澱粉水解++-
纖維素水解++-
40
3.1.3.316S rDNA測序比對結果
下表為菌株測定的序列（已上傳至GenBank獲得登錄號）與GenBank中已 有的序列比對結果，具體基因序列見附錄2。
表3-2菌株的測序結果
The result of 16S rDNA sequence determination
菌株GenBank中與各菌株親緣關係最近的前十個菌株
(GenBank登錄號）|GenBank登錄號| (相似性)
PM-2
(FJ598436)Baci//us cereus strain FM-4 |EU794727| (95%) Baci//us cereus strain NX9 |FJ390480| (95%) Baci//us sp. cp-h63 |EU584552| (95%) Baci//us sp. GUF8 |EU169574| (95%) Baci//us sp. cp-h71 |EU719665| (95%) Baci//us sp. cp-h35 |EU584539| (95%) Baci//us cereus strain IV17 |EU366379| (95%) Baci//us sp. By187(B)Ydz-hh |EU070379| (95%) Baci//us sp. cp-h36 |EU584540| (95%) Baci//us cereus strain W-2 |EU187485| (95%) Baci//us sp. M7-23 |EU706321| (95%) Baci//us sp. M7-20 |EU706318| (95%) Baci//us sp. M7-17 |EU706315| (95%) Baci//us sp. M7-14 |EU706312| (95%)
PM-3
(FJ598437)Baci//us sp. M7-11 |EU706309| (95%) Baci//us sp. M2-3 |EU706291| (95%) Baci//us cereus strain DC11 |EU048539| (95%) Baci//us sp. W-21 |AF390088| (95%) Bac^//-us cereus strain FM-4 |EU794727| (95%) Bac^//-us cereus strain FM-4 |EU719665| (95%) Ochrobactrum anthro^-i |AM490614| (94%) Ochrobactr^um anthrop-i |AM114410| (94%) Ochrobactr^um anthrop~i |AM114409| (94%) Uncultured Ochrobactrum sp. |AY851687| (94%)
PM-4
(FJ598438)Ochrobactr-um sp. Ca-34 |DQ647056| (94%) Ochrobactrum intermedium isolate ADV1 |AF526509| (94%) Ochrobactrum intermedium |AM490631| (93%) Ochrobactrum sp. ROi52 |EF219049| (93%) Uncultured bacterium clone RO238 |EF219037| (93%) Bacterium EAB-2EF12.08 |EU149209| (97%)
3.1.3.4菌株的係統發育樹
經測序後獲得1237bp的PM-2的16S rDNA序列，在GenBank中進行Blast, 挑選同源序列分值較高的有代表性菌株，以strain FM-4 (EU794727)為參比菌株，米用鄰接法(neighbour-joining method, NJ)和最大簡約
41
性法(maximum parsimony method, MP)將PM-2和前十個最相近的菌種的序列作
49
56
644
58
B. C. strain FM-4 (EU794727)
B. sp. cp-h71 (EU719665)
B. sp. cp-h63 (EU584552)
-B. sp. GUF8 (EU169574)
-B. sp. By187(B)Ydz-hh (EU070379) 641 B. C. strain W-2 (EU187485)
B. sp. cp-h35 (EU584539)
B. C. strain NX9 (FJ390480)
-B. sp. cp-h36 (EU584540)
B. C. strain IV17 (EU366379)
PM-2
係統發育樹。（在圖中將說〇7/妨縮寫為B.，cerews縮寫為C.)
0.01
圖3-2基於PM-2菌株和相近的菌株16S rDNA構建的NJ係統發育樹 Fig.3-2 Phylogenetic neighbour-joining tree based on the 16S rDNA genes from the PM-2 strain and their nearest neighbours retrieved from GenBank Databas
57PM-2
51
4
34
4
17
18
B. sp. cp-h36 (EU584540)
B. C. strain NX9 (FJ390480)
B. sp. cp-h35 (EU584539)
B. C. strain FM-4 (EU794727) B. sp. cp-h63 (EU584552)
B. sp. cp-h71 (EU719665)
B. C. strain IV17 (EU366379)
B. sp. By187(B)Ydz-hh (EU070379) B. sp. GUF8 (EU169574)
B. C. strain W-2 (EU187485)
圖3-3基於PM-2菌株和相近的菌株16S rDNA構建的MP係統發育樹
Fig.3-3 Phylogenetic maximum parsimony tree based on the 16S rDNA genes from the PM-2 strain and their nearest neighbours retrieved from GenBank Databas
由以上兩種方法構建的係統發育樹可以看出，PM-2與其他10株親緣關係相 近的菌株的進化差別還是較大，與PM-2堿基差別最小的是cerews1 IV17。
經測序後獲得1089bp的PM-3的16S rDNA序列，在GenBank中進行Blast，
挑選同源序列分值較高的有代表性菌株，以gac///ws sp. M7-23(EU706321)為
42
57
83
B. sp. M7-23 (EU706321)
B. sp. M7-11 (EU706309)
B. sp. M2-3 (EU706291)
B. sp. M7-17 (EU706315)
B. sp. M7-14 (EU706312)
B. sp. M7-20 (EU706318)
■ B. sp. W-21 (AF390088)
B. C. strain DC11 (EU048539)
100
^I B. C. strain NX9 (EU794727) 961巳.C. strain FM-4 (EU719665) PM-3
參比菌株，采用鄰接法和最大簡約性法將PM-3和前十個最相近的菌種的序列作 係統發育樹。（在圖中將說〇7/妨縮寫為B.，cerews縮寫為C.)
0.005
圖3-4基於PM-3菌株和相近的菌株16S rDNA構建的NJ係統發育樹 Fig. 3-4 Phylogenetic neighbour-joining tree based on the 16S rDNA genes from the PM-3 strain and their nearest neighbours retrieved from GenBank Databas
B. sp. M7-23 (EU706321) B. sp. M7-17 (EU706315) B. sp. M7-11 (EU706309) B. sp. M7-14 (EU706312) B. sp. M2-3 (EU706291) B. sp. M7-20 (EU706318)
9
4
6 ■
13
99
45
74, PM-3
B. C. strain DC11 (EU048539) 39■ B. sp. W-21 (AF390088)
B. C. strain NX9 (EU794727)
B. C. strain FM-4 (EU719665)
圖3-5基於PM-3菌株和相近的菌株16S rDNA構建的MP係統發育樹
Fig. 3-5 Phylogenetic maximum parsimony tree based on the 16S rDNA genes from the PM-3 strain and their nearest neighbours retrieved from GenBank Databas
由以上兩種方法構建的係統發育樹可以看出，PM-3也與其他10株親緣關係 相近的菌株的進化差別較大，與PM-3堿基差別最小的是5««+//狀sp.W-21。
經測序後獲得1100bp的PM-4的16S rDNA序列，在GenBank中進行Blast， 挑選同源序列分值較高的有代表性菌株，以5此+//狀sp. M7-23(EU706321)為
43
參比菌株，采用鄰接法和最大簡約性法將PM-4和前十個最相近的菌種的序列作 係統發育樹。（在圖中將廠―縮寫為B.，intermedium縮寫為I.，腫 縮寫為O. Uncultured縮寫為U.)
O.anthropi (AM114410)
O. sp. Ca-34 (DQ647056)
O. anthropi (AM114409)
O. I. isolate ADV1 (AF526509)
O. anthropi (AM490614)
L PM-4
B. EAB-2EF12.08 (EU149209)
O. I. (AM490631)
O. sp. ROi52 (EF219049)
U. B. clone RO238 (EF219037) U. O. sp. (AY851687)
0.1
圖3-6基於PM-4菌株和相近的菌株16S rDNA構建的NJ係統發育樹 Fig. 3-6 Phylogenetic neighbour-joining tree based on the 16S rDNA genes from the PM-4 strain and their nearest neighbours retrieved from GenBank Databas
99
57
77
8
3
2
O. sp. ROi52 (EF219049)
U. B. clone RO238 (EF219037)
U. O. sp. (AY851687)
O. I. (AM490631)
O. sp. Ca-34 (DQ647056)
PM-4
O.anthropi (AM114410)
O. I. isolate ADV1 (AF526509)
O. anthropi (AM490614)
7 1O. anthropi (AM114409)
B. EAB-2EF12.08 (EU149209)
圖3-7基於PM-4菌株和相近的菌株16S rDNA構建的MP係統發育樹 Fig. 3-7 Phylogenetic maximum parsimony tree based on the 16S rDNA genes from the PM-4 strain and their nearest neighbours retrieved from GenBank Databas
由以上兩種方法構建的係統發育樹可以看出PM-4與tfcAro&ctru? sp Ca-34有很近的親緣關係。
以PM-2為參比菌株，采用鄰接法將PM-2、PM-3、PM-4三株菌的序列作
44
係統發育樹。
-PM-2 PM-3 -PM-4
0.05
圖3-8基於PM-2、PM-3和PM-4的16S rDNA構建的NJ係統發育樹 Fig. 3-8 Phylogenetic neighbour-joining tree based on the 16S rDNA genes from the PM-2 PM-3 and PM-4 strains 表3-3三株菌的Tajima測試結果 Table 3-3 Results from the Tajima test for 3 Sequences.
ConfigurationCount
Identical sites in all three sequences (mm)723
Divergent sites in all three sequences 扣諛）15
Unique differences in Sequence A (mijj)28
Unique differences in Sequence B (miji)25
Unique differences in Sequence C (miij)245
Note: The equality of evolutionary rate between PM-2(A) and PM-3(B) is tested using PM-4(C) as an outgroup in Tajima' relative rate test in MEGA4. The % test statistic was 0.17 (P = 0.68028 with 1 degree[s] of freedom). P-value less than 0.05 is often used to reject the null hypothesis of equal rates between lineages.
由圖3-8和表3-3可以看出PM-2和PM-3具有較近的親緣關係，而PM-4
與二者的親緣關係較遠。
3.1.3.5鑒定結果
結合生理生化性質和16S rDNA比對結果可以判斷：PM-2為蠟樣芽胞杆菌， PM-3為枯草芽孢杆菌，PM-4為蒼白杆菌。
3.2菌株的降解性能評價
3.2.1實驗材料與儀器
3.2.1.1主要儀器及設備
DSHZ-300水浴恒溫振蕩器江蘇太倉市實驗設備廠
45
上海山連實驗設備有限公司 北京亞泰科隆實驗科技開發中心 上海申安醫療器械廠 上海第三分析儀器廠 HANNA instrument, USA
SHP-150生化培養箱 YT-CJ-IND淨化工作台 LDZX-50FAS壓力蒸汽滅菌鍋
721型分光光度計 pH計
3.2.1.2培養基
選擇性液體培養基（mg.L-1):聚丙烯酰胺0.3，酵母浸粉0.05, NaN〇3 0.2，， KH2PO4 1.0，MgS〇4.7H2〇 0.2，NaCl 0.5，pH值 7.0。
選擇性固體培養基：向上述培養基中加入15〜20g/L的瓊脂粉，製成平板。 富集培養基（mg-L-1):牛肉浸膏3.0，蛋白腖10.0, NaCl 5。
3.2.2實驗內容與方法 3.2.2.1菌種降解性能評價
采用油田常用的澱粉一碘化鎘方法測定聚丙烯酰胺的含量。生物降解率祝％) 的表達式為：
n=(CQ-C1)/CQX 100%(式 3-1)
式中：C0表示降解前的聚丙烯酰胺含量(mg_L-1); C1表示降解後的聚丙烯酰 胺含量(mg.L-1)。
3.2.2.2生長曲線的測定
將菌種以相同的接種量接入富集培養基（或選擇性液體培養基）中，37°C， 140 r/min培養，每隔一定時間測定培養液的OD600 (或OD470)值，以OD600 (或 OD470)值代表細菌的生物量。富集培養基和選擇性液體培養基在波長為600、 470nm處有各自最大池度值。 3.2.3實驗結果及討論 3.2.3.1細菌的降解組合優化
由於勝利油田采出水中聚丙烯酰胺的含量約為300 mg.L-1，所以選擇性培養 基中聚丙烯酰胺的濃度為300 mg.L-1。在300 mg.L-1HPAM培養基將三株菌進行 組合培養後(按等量原則接種，見表3-3)，最終優化出PM-2與PM-3的混合菌降
46
解效果最好(圖3-9)。
&PM-4
表3-3組合培養時菌株的接種量 Table 3-3 Inoculum size of combined cultivation
組合■接種量（mL)
PM-2PM-3PM-4
300
單株菌030
003
1.51.50
兩株菌1.501.5
01.51.5
三株菌111
圖3-9菌株組合培養對聚丙烯酰胺的降解率 Fig. 3-9 Degradation rate of single bacterium and the mixed
三株菌共同混合的降解效果並不最優，這可能是由於三株菌之間存在拮抗作 用。由圖3-9可以看出，PM-4可能與其他兩株菌存在拮抗作用。組合培養含有 PM-4的菌株，降解效果都不如單株菌的效果。而PM-2、PM-3的組合表現協同 效應，其降解效果優於單株菌的降解效果，降解率可達42 %。這可能是由於 PM-2和PM-3具有較近的親緣關係，而與PM-4的親緣關係較遠（詳見3.1.3.4 菌株的係統發育樹)。
3.2.3.2細菌的生長及pH值的變化
測定微生物的生長曲線對於了解微生物的生長特性是十分必要的。分別測定
47
PM-2、PM-3和兩者混合在富集培養基（圖3-10)和選擇性培養基（圖3-11)中 的生長曲線。混合菌的生長曲線，在富集培養基中與PM-2的生長曲線類似，說 明在富集培養基中，PM-2為優勢種群，而在選擇性培養基中，在生長前期與PM-2 的生長曲線類似，而生長後期與PM-3類似，說明在含有PAM的選擇性培養集 中，在生長前期PM-2為優勢種群，而後PM-3的貢獻開始逐漸增加，在生長後 期PM-3為優勢種群。
圖3-10菌株在富集培養基中的生長曲線 Fig. 3-10 Growth curve of single bacterium and the mixed in enriched medium
圖3-11菌株在選擇性培養基中的生長曲線 Fig. 3-11 Growth curve of single bacterium and the mixed in selective medium
48
圖3-12在選擇性培養集中菌株生長過程中pH變化 Fig. 3-12 pH change in vegetation process of single bacterium and the mixed in selective medium
為探究混合菌在選擇性培養基生長的更多特性，在測定生長曲線的同時，還 測定了 PM-2、PM-3和二者的混合在選擇性培養基生長過程中的pH變化。由圖 3-12可以看出，在生長過程中，pH值先降低後增大。pH的降低，可能是培養基 中酵母浸粉被細菌利用而產生酸性物質使pH值降低。在生長後期，酵母浸粉被 利用完，產生的酸性物質也被細菌利用轉化為中性物質而使pH值又有所回升。 PM-2與PM-3混合中，在生長前段時期，即前十五個小時，溶液的pH值變化， 由PM-2控製，隨後，PM-3對pH值的貢獻開始增大，這與混合菌生長曲線的測 定結果相一致。
3.3混合菌降解條件優化
3.3.1實驗材料與儀器
實驗材料與儀器同3.2.1 3.3.2實驗內容與方法 3.3.2.1菌種降解聚丙烯酰胺的性能評價
采用油田常用的澱粉一碘化鎘方法測定聚丙烯酰胺的含量，詳見3.2.2.1。 3.3.2.2菌種降解原油的性能評價
49
采用中華人民共和國石油天然氣行業標準：油田汙水中石油類含量測定方法 —分光光度法（SY/T 0530-93)。
3.3.3實驗結果及討論
3.3.3.1混合菌生源條件優化
由於聚丙烯酰胺屬於難降解的高分子有機物，需向其溶液中添加營養元素以 促進聚丙烯酰胺的降解。
1)碳源的選擇
實驗用碳源為葡萄糖、蔗糖、液體石蠟、原油。四種碳源分別以質量分數為 0.2 g.L-1的用量分別加入基礎培養基。PM-2與PM-3混合菌在40°C培養3天後， 測定降解率。如圖3所示。
圖3-13不同碳源對降解率的影響 Fig. 3-13 The effect of carbon sources on HPAM degradation
由圖3-13可以看出，加石蠟一組的降解效果最好，加原油的效果次之。加 入葡萄糖和蔗糖的降解效果不如石蠟和原油，原因可能是加入好利用的碳源葡萄 糖和蔗糖後，對聚丙烯酰胺的利用下降。考慮到本實驗最終目的是將混合菌應用 到實際油田采出水中，處理實際條件下的油田廢水中聚丙烯酰胺，故選用原油作 為碳源。但在活化細菌時使用石蠟作為碳源。
以原油為碳源，考察了降解菌對不同濃度的原油的降解情況。首先測定了原 油濃度隨吸光度變化的標準曲線。結果如圖3-14。相關係數R2=0.9994，曲線方
50
程為 y=0.01258x-0.03018。
圖3-14原油濃度的標準曲線 Fig.3-14 The standard line of crude oil concentration
在40°C培養3天後測定了細菌對原油的降解率（圖3-15)。由圖中可以看出 隨著原油濃度的增加，原油降解率呈下降趨勢。當原油濃度為50 mg_L-1時降解 率為73.1 %，而原油濃度增大為500 mg-L-1時，降解率下降為15.4 %。一般產出 水中原油為200-300 mg.L-1，在此範圍內降解菌降解率在25%-40 %之間。
圖3-15降解菌對不同濃度的原油的降解率 Fig.3-15 The degradation rate of crude oil by the strains
51
2)氮源的選擇
實驗用外加氮源選擇為NH4CI、NaN〇3、（NH4)2S〇4、NH4NO3、蛋白腖。五
種氮源分別以0.2 g.L-1的用量分別加入基礎培養基。40°C培養3天後，測定降解 率（圖4)。
圖3-16氮源對降解率的影響
Fig. 3-16 The effect of nitrogen sources on HPAM degradation
由圖3-16可以看出，加入氮源後降解率都不如不加氮源的降解效果好。這 可能是細菌在基礎培養基中生長代謝，利用聚丙烯酰胺的胺基作為氮源，從而降 解聚丙烯酰胺，而加入好利用的氮源以後，細菌優先利用其他氮源，而利用聚丙 烯酰胺中胺基的效率下降，從而導致聚丙烯酰胺的降解率下降，這也與 Kay-Shoemake等[70]的研究結果相一致。但在實驗中，以原油為碳源時仍需加入 少量外加氮源以提高對原油的降解率。由上圖可以看出NaNO3對降解的影響比較 小，選擇NaNO3為附加氮源。
3)磷源的選擇
實驗用的磷源隻考察了KH2PO4、K2HPO4及KH2PO4-K2HPO4緩衝體係磷源， 同時以未加磷源的培養基作為對比。KH2PO4、K2HPO4及KH2PO4-K2HPO4 (roKH2PO4:roK2HPO4=1:1)都以1g/L的用量加入培養基。在相冋條件下培養3天， 測定聚丙烯酰胺降解率（圖3-17)。
52
5-
0
Non-P
K2HPO4KH2PO4 K2HPO4&
KH2PO4
圖3-17不同磷源對聚丙烯酰胺降解率的影響 Fig. 3-17 The effect of phosphorus source on HPAM degradation
由測定結果可以看出，沒有磷源的一組聚丙烯酰胺的降解率遠遠低於含有磷 源的三組。這可能是細菌在降解聚丙烯酰胺的過程需要消耗大量的ATP (三磷酸 腺苷）和活性酶，因此需要充足的磷源來補充消耗。而KH2PO4-K2HPO4緩衝體 係磷源的一組比KH2PO4和K2HPO4的單一磷源降解率高，這可能是 KH2PO4-K2HPO4組成的緩衝體係使溶液的pH值穩定，有利於細菌的生長與代謝。
考察了KH2PO4-K2HPO4 (WKH2PO4:WK2HPO4=1:1 )的用量對微生物降解聚丙烯 酰胺的影響（圖3-18)。當KH2PO4-K2HPO4的用量為1 g.L-1時其降解率就達到 穩定值，此時磷源已足以滿足降解的需要，所以選擇KH2PO4-K2HPO4的用量為1 g-L"1。
53
_ _ I _ I _ I _ I
0 5 0 5 0 4 3 3 2 2
% / 3SJ UOI^PSSSQ
0.00.20.40.60.81.01.21.41.6
Concentration of phosphorus source / gL 1
圖3-18磷源濃度對降解率的影響
Fig. 3-18 The effect of phosphorus source concentration on HPAM degradation
3.3.3.2混合菌生長條件優化
1)降解時間的影響
Fig. 3-19 The change of degrading rate and the pH in vegetation process of the mixed bacteria
測定了 PM-2、PM-3混合菌在選擇性培養基生長過程中對HPAM降解率的 變化。由圖3-19可以看出，混合菌對聚丙烯酰胺的降解主要是在前3天內，在 之後的時間裏，降解率基本穩定。所以本實驗把第3天作為降解實驗的終止。在 混合菌降解過程中，pH值略有所降低，一方麵聚丙烯酰胺水解產生羧基，另一 方麵細菌新陳代謝過程中可能產生酸性物質。
圖3-19降解率和pH值隨時間的變化曲線
54
2)活化次數的影響
取經過不同連續活化次數的相同菌濃的試驗用混合菌菌液，按照同樣比例接 種到300mg/L的HPAM中，37°C恒溫培養3天後，測定PM-2、PM-3混合菌
對HPAM溶液降解率的變化（圖3-20)。
圖3-20活化次數對降解率的影響 Fig. 3-20 Degrading rates under different times of activation
結果表明隨活化次數的增加聚丙烯酰胺的降解程度逐漸增大。在HPAM的 生物降解過程中，微生物都有適應新的營養來源的能力。細菌與HPAM接觸後 並不會立即進行分解反應，而是要經過一段時間的誘導適應，當通過活化而使細 菌經曆了誘導適應過程後再重新與HPAM溶液接觸，就會大大縮短誘導時間， 使細菌降解能力得到提高。測定在選擇性培養基中生長曲線時，混合菌已被活化 5次，所以在生長過程中基本沒有延滯期。結合測定結果與實際的實驗條件連續 活化次數選擇為4次。
3)接種量的影響
將PM-2、PM-3混合菌向培養基中分別按不同的體積分數接種。在同等條件 下培養3天後測定。
55
0 5 0 5 0 1 3 2 2 1 1
% / 9SJ uolspsg9Q
iIIIiIIII
012345678 Amount of inoculation / %(volume fraction)
圖3-21接種量對降解率的影響
Fig. 3-21 the degrading rate under different amount of inoculation
從圖3-21可以看出，混合菌初始接種量對聚丙烯酰胺溶液的降解率影響較 大，HPAM溶液的降解率隨接種量的增加而增大。當接種體積分數為3%時，聚 丙烯酰胺溶液降解率達到穩定值，但當接種量增加到一定程度，溶液的降解率不 再有明顯的增加，甚至有所下降。這可能是由於接種量增加而造成混合菌生長空 間及營養供應不足，使混合菌的生長繁殖、代謝受到抑製，因此選擇初始接種體 積為3 %。
4)培養溫度的影響
分別設定了不同的生長溫度，在同等條件下靜置培養一周。測定不同溫度下 PM-2、PM-3混合菌對300 mg.L-1 HPAM溶液的降解效果。聚丙烯酰胺溶液的降
解率進行了測定，從而確定了降解實驗的最佳溫度。由於是靜止培養，供氧明顯 不足，細菌生長緩慢，降解率皆偏低。由圖3-22可以看出，細菌對聚丙烯酰胺 溶液降解程度較高的溫度範圍是35 °C-45 °C。溫度高於50 °C對降解實驗會產生 極大的影響，聚丙烯酰胺的降解率低於2 %。
56
圖3-22溫度對降解率的影響 Fig. 3-22 the degrading rate under different temperature
5)初始pH值的影響
圖3-23 pH值對降解率的影響 Fig.3-23 Degrading rate under different pH
配製300mg/L的聚丙烯酰胺培養基，考察了初始pH值為5.0〜9.0範圍內 PM-2、PM-3混合菌對聚丙烯酰胺的降解情況。結果見圖3-23。實驗結果表明， 初始pH值的不同對聚丙烯酰胺溶液中的細菌產生了一定的影響。本實驗中篩選 到的聚丙烯酰胺降解菌，最適pH值範圍是6.0-7.5。過高或過低的pH值都不利 於聚丙烯酰胺的降解。
6)氧含量的影響
57
在搖瓶試驗中，含氧量的直接控製和測定都比較困難，通常利用改變搖床轉 速的方式調節含氧量，提高轉速是提高液體培養基氧含量的重要手段，轉速對菌 株的生長和聚丙烯酰胺的降解的影響如圖3-24。結果表明，該菌株是好氧菌， 隨著供氧量的增加，生物量也迅速增加。考慮搖床轉速的限製，通常選擇的搖床 培養轉速為140 rmin-1。
圖3-24搖床轉速對聚丙烯酰胺降解的影響 Fig. 3-24 Degrading rate under different shaker rotate speeds
7)礦化度的影響
試驗結果表明，細菌生長和對聚丙烯酰胺的降解活動對礦化度有一定的要 求，礦化度過低、過高均不利於菌種對聚丙烯酰胺的降解。如圖3-25所示，礦化 度在25000-10000 mg.L-1之間時對聚丙烯酰胺的降解效果較好，高於10000 mg-L-1 有明顯變化。礦化度的影響與菌種的生理特性密切相關，在礦化度為2500-10000 mg*L-1的條件下，外界提供細菌生長所需的條件，對聚丙烯酰胺的降解效果最好， 礦化度增加，細胞脫水，當礦化度達到一定程度時導致細菌的死亡，降解效果變 差。
% / 9SJ uol^p亡Jg9°
5 0 5
02500 5000 7500 10000 12500 15000
Minerlization content/mg-L"1
圖3-25礦化度對聚丙烯酰胺降解率的影響 Fig. 3-25 Degrading rate under different minerlization content
3.4本章小結
1)初步篩選到三株好氧的聚丙烯酰胺降解菌種，分別命名為PM-2、PM-3、PM-4。 通過生理生化性質和16S rDNA鑒定，PM-2為蠟樣芽胞杆菌，PM-3為枯草芽孢 杆菌，PM-4為蒼白杆菌。
2)將三株菌進行混合正交培養後，優化出PM-2與PM-3的混合菌降解效果最好， 300 mg.L-1聚丙烯酰胺溶液的降解率最高可達到42 %。
3)優化了混合菌降解條件，選擇原油為碳源，KH2PO4-K2HPO4緩衝體係為磷源， NaN〇3為輔助氮源。最佳降解時間為3天，連續活化次數為4次，接種體積分數 為3 %，溫度為35°C-45 °C，初始pH值為6.0-7.5,搖床轉速為140 r-min"1，礦化 度為 2500 "10000 mg-L"1。
4聚丙烯酰胺降解機理的初探
聚丙烯酰胺的降解通常分為氧化降解、生物降解、機械降解和熱降解等類型 [7]。近年來,人們對HPAM降解機理的研究主要集中在兩個方麵：化學降解和生物 降解。
4.1HPAM的化學降解機理研究進展
HPAM的化學降解又可分為氧化降解、光降解和光催化降解[7]。
4.1.1HPAM的氧化降解反應機理
HPAM的氧化降解反應機理是自由基反應機理。
朱麟勇等[71-73]研究了 HPAM的氧化降解反應機理。研究認為HPAM的氧化降 解包括兩個主要過程：（1)自動氧化過程；（2)連鎖裂解過程。在氧化降解過程中 首先由於商品聚丙烯酰胺(以P-H表示)帶有的過氧化物雜質(以POOH表示)分解 產生初級自由基，引發連鎖自動氧化反應，當升溫或微量還原性物質存在時，這 種自動氧化反應顯著加速。促進聚合物鏈自由基(P•和PO0的產生（圖1)。
圖4-1 HPAM的氧化降解反應機理
Fig. 4-1 The mechanism of HPAM5s oxidative degradation
引發的連鎖氧化反應可表示為式(4-1)〜式(4-4)，
POOH ^ PO*+*OH
60
P-H+.〇H^P-+H20 P«+02 ^POO* POO-^POOH +P.
(4-2)
(4-3)
(4-4)
隨後，聚合物鏈上的自由基引發a-裂解反應和p-裂解反應，使主鏈斷裂(式 (5)〜式(8)),
(4-6)
(4-5)
(4-7)
(4-8)
a-
在缺氧條件下，鏈自由基發生分子鏈間偶合反應，生成一定交聯結構。
裂解反應和p-裂解反應引起聚合物斷裂，使聚合物分子量迅速下降，同時伴隨發 生脫酰胺或脫羧反應，產生不同氧化降解產物，值得指出，這種氧化降解的連鎖 反應具有較大的動力學鏈長，因此微量氧足以引起溶液粘度的大幅度降低。在缺 氧條件下，鏈自由基發生分子鏈間偶合反應，生成一定交聯結構。詹亞力等[7,74] 在研究聚丙烯酰胺氧化降解時做出類似推斷。
張鐵鍇等[27]研究了 Fenton試劑氧化降解聚丙烯酰胺的機理。在其建立的機理 模型中，壓〇2在Fe(II)存在下生成-OH，同時體係中生成的[Fe(III)(H〇2)]2+又可 再生Fe(II)。這個模型也包括.HO2AO2-和.OH的傳遞反應以及終止反應。其機理 可表示如下：
鏈的引發
(4-9)
(4-10)
(4-11)
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(4-13)
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(4-16)
(4-17)
Fe2++H2〇2+OIT+.OH
Fe3++H202 ^[Fe(m)(H02)f++H-
[Fe(m)(H02)]2+^Fe2++H02
.〇H+H2〇2 ^H〇2-+H2〇
鏈的傳遞 鏈的中止
P-H +*0H ^Inorganic
Fe2++*OH ^Fe3+ + OH_
Fe2+ +-0H ^Fe3+ + OH-
+HC^.^Fe2++C^ t +1^
H〇2*+H〇2*—^H2〇2 + 〇2 個
王寶輝等[28]對高鐵酸鉀氧化去除油田汙水中聚丙烯酰胺進行了研究。對高 鐵酸鉀氧化HPAM反應機理進行推斷如下：
FeO2"+H++ (CH2—CH2)^CONH2 —(CH2—CH2)^CONH2+FeO4.—
CH2 = CH2—CONH2+CH2 = CH2 —COOH +HFeO4- — CO2 個 +H2O + Fe3+ +NO3 +N2 個
(4-18)
其過程首先是HPAM斷鏈，變成更小的HPAM分子，這一步反應很快，繼 而氧化成單體和丙烯酸等，最後生成無機物。由此而使HPAM降解和降粘。
在製備K2FeSO4純品時產生大量的濾液中含有飽和K2FeSO4和大量未反應的 KClO,具有強氧化性，是很好的氧化劑。陳穎等[29, 75]研究了高鐵酸鉀濾液對油 田三元複合驅模擬汙水的降解。降解機理如下：
4K2FeO4 + 10H2O ^ 4Fe(OH)3 + 3O2 + 8KOH(4-19)
(4-20)
O•可直接氧化HPAM或與HPAM作用，發生鏈式反應，最後生成小分子的 聚丙烯酰胺直至完全礦化。
(HPAM“ --[O^U(HPAM)m + (HPAM)„ - O(4-21)
(HPAM)OT [O] > mAM(4-22)
AM [O]^ CO2 T + H2O + N2 T +OH- + CO2-(4-23)
HPAM + ClO> CO2 T+ H2O + N2 T+ C〇2-(4-24)
在堿性條件下K2FeO4與聚合物反應時，聚合物中氫過氧化物主要是在N原子 a位的亞甲基上形成，但該氫過氧化物由於籠蔽效應並不引發新的氧化鏈，過氧 化物均裂生成的羥基自由基與烷氧自由基重新反應生成酰亞胺和水。根據雙分子 分解機理，可直接得到酮和水，最終產生的仍是酰亞胺和水，含CIO-的濾液繼續 氧化中間產物，最終生成CO2和H2O等小分子化合物。高鐵酸鉀濾液具有更好的氧 化效果，這是因為存在C1O-和FeO42-的協同作用所致。
4.1.2HPAM的光降解機理
已有的研究表明：自然光和紫外線照射可以直接使HPAM降解。
Smith等[62]用不同的天然水源配製HPAM溶液，置於用塑料膜封口的玻璃瓶 中，日光經過瓶口照射溶液，觀察6周時間內溶液中AAM、NH4+和pH的變化。 結果發現，一段時間後溶液中單體AAM顯著增長，NH4+下降，微生物濃度未見 明顯改變。這說明HPAM鏈在環境條件下發生了分裂，但單體不會明顯變化，且 降解的主要原因是光致裂解，而非生物降解。研究認為HPAM的光致降解可以用 鍵能的大小來解釋：HPAM中C-C，C-H，C-N鍵的鍵能分別為340 , 420和414 kJ-mol-1，因此相應地要斷裂這些鍵所對應的波長分別為325、250和288 nm。 但由於臭氧層的存在，吸收了 286-300 nm的全部輻射，因此太陽輻射隻能使C-C 鍵斷裂，而對C-H和C-N鍵影響很小。
在實驗室條件下，羅一菁等[76]在有紫外燈光照射存在的情況下，聚丙烯酰 胺能發生單純的光解反應。經過80 min的照射，聚丙烯酰胺的濃度降為起始濃度 的50 %左右。陳穎等[77]研究紫外光降解情況也得出相同的結論。
4.1.3HPAM的光催化降解機理
大量的研究表明，光催化法對環境汙染物有很好的去除效果，反應過程中產 生強氧化性基團(主要是_OH)，通過自由基使很多生物難降解的物質最終可以達 到完全礦化。特別是對傳統的化學方法難以除去的低濃度汙染物，光催化效果更 顯著[77]。
雒維國等[78]考察了暗箱、50 W自然光源、25 W紫外燈、125 W中壓汞燈環 境下的對催化1102降解聚丙烯酰胺的情況。結果表明：暗箱中PAM水溶液光催 化效果最差，中壓汞燈的效果最好，因為在光催化降解過程中，光源所發出的所 有光中起作用的是紫外或接近紫外部分的光，波長小於385 nm的紫外光可以實 現Ti〇2的光催化，同時光的強度越大，能量利用率越高，中壓汞燈光強度很大， 光反應的活化能來源於光子能量，可以將光子看作反應物，而自然光光源光譜在 短波部分的輻射強度最弱，發出的紫外光能量低，因此暗箱和自然光對該反應基 本無促進作用。光反應的活化能來源於光子能量，可以視光子為反應物，因此， 光源的能量分布及光強度大小對反應速度都有明顯的影響。
羅一菁等[76]、陳穎等[77]也對光催化降解聚丙烯酰胺的情況進行研究，得出 相同的結論。
4.2HPAM的生物降解機理研究進展
生物降解是指有機物在生物酶的作用下，經過一係列的生物化學反應轉化為 簡單化合物的現象，有時可完全轉化為無機物[79]。聚合物的生物降解是指在生 物作用下，聚合物發生降解、同化的過程。許多微生物並不是天生就具有降解聚 合物的能力，而是通過馴化而逐漸適應的，即催化降解聚合物的酶係是通過馴化 而誘導出的。起降解作用的微生物主要包括細菌、真菌和藻類，作用機理主要可 分歸三類：（1)生物物理作用；由於生物細胞增長而使聚合物組分水解、電離或 質子化而發生機械性破壞，分裂成低聚物碎片；（2)生物化學作用；微生物對聚 合物作用而產生新物質(CH4, CO2和H2O); (3)酶直接作用；被微生物侵蝕部分
64
導致聚合物鏈的斷裂或鏈的氧化。生物降解並非單一機理，是複雜的生物物理、 生物化學協同作用，並同時伴有相互促進的物理、化學過程[79-80]，如圖4-2所示:
生物物理作用^
簡單化合物 如：CH4、 C〇2、H2O、
有機酸等
分裂成低聚物碎片(HPAM)„、（HPAM)m
微生物生物化學作作用協同作用&
()n+m生長代謝|低聚物碎片分解成更簡單化合物—'
酶的催化氧化
^C-C、C-N鍵斷裂，酰胺基被氧化為羧基:V
圖4-2 HPAM生物降解機理
Fig. 4-2 The biodegradation mechanism of HPAM
4.2.1生物降解機理的國外進展
國外研究者一般認為HPAM隻能在細胞外酰胺酶的作用下作為氨源被微生 物利用，而作為碳源利用非常困難；但也有研究者認為可以作為碳源利用；有人 認為聚丙烯酰胺因為具有與氨基酸相近似的結構而被微生物所代謝[81]；近年來， 國外研究者發現水解聚丙烯酰胺的降解產物可作為細菌生命活動的營養物質，反 過來營養的消耗又會促進HPAM的降解[32]；但研究者有一個共識：聚丙烯酰胺具 有強的生物抗性，屬於難降解的有機物。
Suzuki等[32]發現聚丙烯酰胺和聚丙烯酸鹽隻在好氧的條件下被微生物輕微 地降解，實驗中使用的體積排阻色譜和總有機碳測定分析方法。實驗發現隻有在 高濃度的情況下有輕微降解，甚至是被臭氧氧化後的小分子（分子量從280,000 降解到840)也具有極強的生物抗性。認為聚丙烯酰胺的生物抗性不僅與其高的 分子量有關還與其特殊的碳鏈骨架有關。
Mourato和Gehr[82]研究表明丙烯酰胺/二烯丙基二甲基氯化銨的共聚物在 混合好氧培養基中沒有被降解，但是丙烯酰胺/丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨的共 聚物有一定的氧氣消耗，這部分氧氣的量比聚丙烯酰胺全部降解的需求量少，所 以是部分降解。研究還表明無論是在丙烯酰胺/二烯丙基二甲基氯化銨的共聚物 還是丙烯酰胺/丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨的共聚物存在的條件下都沒有影響 葡萄糖的降解。
Soponkanaporn和Gehr[83]通過體積排阻色譜法檢測到微生物對丙烯酰胺/
65
丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨的好氧降解。研究結果表明聚丙烯酰胺可作為碳源被 降解為C〇2。
Schumann and Kunst [84]用14C標記的陰離子的聚丙烯酰胺和陽離子的聚丙烯 酰胺在活性汙泥中降解作用。研究表明兩種聚合物都沒有被顯著降解(小於2%)。 在厭氧環境中也得到類似的結論，沒有任何一種有顯著的厭氧降解。
Grula等[85]研究了厭氧菌一硫酸鹽還原菌對聚丙烯酰胺的降解作用。研究 表明聚丙烯酰胺和部分水解聚丙烯酰胺可促進硫酸鹽還原菌的生長。聚丙烯酸具 有一定程度的生物毒性，而陽離子的聚合物對硫酸鹽還原菌降解具有很強的抗 性。Schumann and Kunst (1991)研究表明這部分的碳表現了聚丙烯酰胺碳骨架 的生物抗性。Grula等也研究了土壤中好氧細菌對聚丙烯酰胺的降解情況，包括 了陰離子的、非離子的和陽離子的聚丙烯酰胺。非離子的和陰離子的聚丙烯酰胺 可作為唯一氮源促進假單胞屬的幾個種的細菌的生長。氮源來自於聚丙烯酰胺產 生的丙烯酰胺產生中酰胺基的水解。酰胺基的水解是通過假單胞菌產生的酰胺水 解酶進行的。而聚丙烯酰胺的碳骨架[-CH2-]不能被降解。陽離子的聚丙烯酰胺 在任何條件下也不能被微生物利用，對生物具有極高的毒性。
Kunichika N[48]等在30°C下從活性汙泥和土壤中分離出能以水溶性聚丙烯酰 胺為唯一碳源和氮源的 Enterobacter agglomerans 和 Azomonasm acrocytogenes 兩株 好氧降解菌株。實驗表明，微生物隻能利用聚丙烯酰胺中的一部分，而不能利用 其中的酰胺部分，即使是低濃度的聚丙烯酰胺也不能全部被利用。
Larson等[86]報道了活性汙泥中微生物對聚丙烯酸的寡聚物和聚合物的降解 情況。研究表明丙烯酸單體和二聚體可以被完全降解為二氧化碳。丙烯酸的寡聚 物（一直到七聚體）可以被部分降解。對於更高分子量的聚合體（1000-4500) 降解能力下降很多，分子量超過1〇6就不可被降解。
8說匕6^3〇4等[42]對白腐真菌降解聚丙烯酰胺進行研究發現：白腐真菌隻在限 氮的條件下對聚丙烯酰胺的有顯著降解，且降解速度比在氮充足的條件下快兩倍 多。這表明白腐真菌是把聚丙烯酰胺作為氮源利用，進而對其降解。
Kay-Shoemake等[70 ,87]研究證實在聚丙烯酰胺存在下土壤中好氧微生物會 產生酰胺水解酶，並可以將聚丙烯酰胺作為唯一氮源促進土壤中好氧微生物的生 長。聚丙烯酰胺先被轉化為長鏈聚丙烯酸酯，而後者可以被微生物作為氮源利用。
66
但是聚丙烯酰胺（PAM)的主碳鏈骨架不能被微生物利用，而且聚丙烯酸（PAA) 也不能作為碳源被利用。研究者還報道了被機械剪切或紫外降解後的小分子的聚 合物（分子量為3000-4000)也同樣不能作為碳源利用。
Sojka等[88]研究了聚丙烯酰胺在土壤中的應用對微生物的影響。研究發現使 用聚丙烯酰胺的土壤中的細菌、真菌的總量要比沒有聚丙烯酰胺的土壤中的要 少。聚丙烯酰胺的應用可以潛在地控製致病菌在水土中的轉移傳播。
Chang等[89]考察了在好氧環境和厭氧環境微生物對丙烯酰胺/丙烯酰氧乙基 三甲基氯化銨共聚物的降解情況，好氧環境采用耗氧量評價，厭氧環境采用氣體 產生量評價。研究表明聚合物在好氧和厭氧環境中都可以被微生物部分降解。但 都隻是陽離子的那部分被降解，主碳鏈沒有受影響。
El-Mamouni等[39]利用光降解和生物降解聯用來降解大分子量的聚丙烯酰 胺。利用紫外光降解提高聚丙烯酰胺的可生化性。即使紫外光降解破壞了聚丙烯 酰胺的大分子結構，微生物也很難全部利用聚丙烯酰胺。考察了紫外光降解後好 氧菌和厭氧菌對聚丙烯酰胺的降解情況。結果表明好氧降解比厭氧降解對聚丙烯 酰胺的利用度高。
Haveroen等[3]研究了在厭氧條件下聚丙烯酰胺（一種絮凝劑）對微生物的產 甲烷作用的促進機製。研究表明，聚丙烯酰胺可作為唯一氮源促進微生物的生長 和提高甲燒的產生量。
Hollimana等[5]研究了交聯聚丙烯酰胺凝膠在土壤中的降解情況，考察了化 學、物理、生物降解對聚丙烯酰胺的影響。研究表明交聯聚丙烯酰胺凝膠對微生 物降解具有很強的抗性，在土壤中微生物群落產生的酰胺酶的作用下，發生非常 緩慢降解。Sojka等[90]研究了在一段長時間（6月、7月、8月三個月）內聚丙烯 酰胺對土壤中微生物的群落的影響。雖然聚丙烯酰胺在土壤中的應用在某些情況 下會減少細菌和真菌的總量，但對於微生物潛在的新陳代謝沒有很大影響。 Caesar-TonThat[91]等研究了在有聚丙烯酰胺存在的土壤中微生物群落的情況。研 究表明向土壤中添加聚丙烯酰胺促進了一些特殊的真菌（擔子菌）和細菌的生存 和生長。
67
4.2.2生物降解機理國內進展
由於聚合物驅在油田的大範圍使用以及含聚汙水的逐年增加，國內研究者對 於含聚丙烯酰胺汙水的處理研究逐漸增多。而國內對聚丙烯酰胺的降解研究也基 本集中在對采油用的陰離子型部分水解聚丙烯酰胺（HPAM)開展的，相對於國 外對機理的研究有更深入的探討。
有研究者認為HPAM能作為唯一的碳營養源被硫酸鹽還原菌所代謝。黃峰等 (2002) [35]的研究結果表明：硫酸鹽還原菌不僅能以HPAM為碳源生長繁殖，而 且還能使HPAM降解導致其溶液粘度損失，可降低HPAM驅油效率。程林波等[24] 研究硫酸鹽還原菌（SRB)降解聚丙烯酰胺表明：硫酸鹽還原菌以HPAM作為碳 源，以S〇42-作為最終電子受體進行生長、繁殖，對HPAM進行分解代謝，從而起 到降解HPAM的作用。
李宜強等（2007) [49]提出了微生物的好氧降解聚丙烯酰胺的機理。研究表 明微生物體內的脫氨酶在還原性酶的輔助作用下，首先斷開HPAM中的C-N鍵， 解離出NH2-離子，而該NH2-原來的位置被OH-所取代，生成-COOH;同時，在〇2 的參與下，微生物酶首先進攻的位點是碳鏈的末端甲基，在單加氧酶的作用下， 碳鏈末端甲基首先被氧化成醇，進而被氧化成羧酸，且羧基的第二個氧原子是從 H2O中引入的。如果a-碳原子上取代有1個甲基，這時P-氧化的結果隻產生丙酰 COA而不是乙酰COA。如果在P-碳原子上取代有其它基團或在同一碳原子上取代 有2個甲基後在碳鏈末端碳原子上取代有3個基團，那麽就會抗P-氧化，因為P- 氧化要求P-原子上沒有取代基。但是在微生物中存在有a-氧化（即從碳鏈上移去 1個碳原子），這樣就可以避免P-原子上存在取代基而無法被微生物分解的情況。 經過一係列有各種微生物酶參與的氧化反應，長鏈的HPAM就被斷裂成短鏈及可 被微生物吸收的小分子有機物。這些有機物以及從HPAM中解離出來的NH2-提供 了微生物新陳代謝所必不可少的碳源和氮源。用於合成蛋白質和其它含氮、含碳 有機物質。整個降解HPAM的過程需要消耗大量的ATP (三磷酸腺苷）能量(627.83 J-mol-1)和還原性輔酶，所以要提供足夠的磷源。
68
CC
II
C——CTTC——C-pC^rC——C COOH
t丨f個
f代表a-氧化的位點；#代表氧化的位點
圖4-3 a-氧化和P-氧化作用位點的示意圖 Fig. 4-3 The position of a-oxidation and P-oxidation
劉永建等[43]在實驗的基礎上推斷了降解菌降解聚合物的生物機理。微生物 通過胞外蛋白水解一CONH2，使C一N鍵斷裂時，通常會出現少量-CHO、-C-O 自由基等不穩定中間產物，它們大部分會在胞外蛋白作用下繼續反應生成 -COOH。降解菌會在繁殖過程中產生一係列還原性代謝產物，它們能夠同聚合 物中的氧化物發生自由基氧化還原反應；聚合物側鏈上的不穩定中間體會受此攻 擊，導致P碳原子和Y碳原子之間的C-C鍵斷裂，使碳鏈變短。由於反應後基本未 出現新基團，所以C-C鍵斷裂處主要是生成-CH3和-COOH等基團，形成新的穩定 形態（圖4-2)。
Fig.4-4 The products of HPAM biodegradation
郝春雷等[50]研究了複合菌降解菌降解聚丙烯酰胺的不同作用。有的菌種主 要依靠所分泌的胞外蛋白降解聚合物，數種蛋白組成複雜的降解酶係，共同作用 於聚合物使之降解，而有的菌種則釋放非蛋白類還原性物質作用於聚合物。
69
4.3HPAM生物降解的機理初探
4.3.1實驗材料與儀器 4.3.1.1菌種來源
實驗室分離的菌株PM-2和PM-3。 4.3.1.2主要儀器及設備
DSHZ-300水浴恒溫振蕩器江蘇太倉市實驗設備廠
SHP-150生化培養箱上海山連實驗設備有限公司
YT-CJ-IND淨化工作台北京亞泰科隆實驗科技開發中心
LDZX-50FAS壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠
AVATER 360FT-IR 型紅外光譜儀 Nicolet, USA
721型分光光度計上海第三分析儀器廠
pH計HANNA instrument, USA
JSM-6700F掃描電子顯微鏡日本電子公司
LC-6AD高效液相色譜日本島津
UV-2450紫外可見分光光度計日本島津
HCT-1熱分析儀北京恒久科學儀器廠
4.3.1.3培養基
富集培養基（g*L-1):牛肉浸膏，3.0;蛋白腖，10.0; NaCl，5; pH值7.0-7.2。 基礎培養基（g.L-1):聚丙烯酰胺，0.3;酵母浸粉，0.1; KH2PO4，1.0; MgSO4.7H2O，0.2; NaCl，0.5; pH值 7.0-7.2。
固體斜麵培養基：向基礎培養基中加入15-20 g_L-1的瓊脂粉，製成平板。
70
4.3.2實驗內容與方法 4.3.2.1菌液製備和培養
將保存於4 °C冰箱中固體斜麵培養基的2株菌取出，在無菌操作條件下，將 2株細菌接種於富集培養基，在40 °C恒溫搖床(轉速140 rmin-1)活化富集1天。 活化後的菌株在無菌條件下，用無菌注射器吸取一定量的菌液接入100 mL滅菌 後的基礎液培養基中，於40 C恒溫搖床(轉速140 r_min-1)中培養3天後，用無 菌注射器吸取混合菌菌液再轉接入新的100 mL滅菌後的基礎液培養基，培養3 天，如此再重複轉接兩次，作為種子培養基。實驗時，將種子培養基以一定量接 入實驗培養基中。
4.3.2.2菌種降解性能評價
采用油田常用的澱粉一碘化鎘方法測定聚丙烯酰胺的含量，詳見3.2.2.1。 4.3.2.3儀器條件
液相色譜條件Shim- pack Vp-ODS(150x4.6 mm)色譜柱，流動相為甲醇:水 =1:1，流速為0.5 mL-min-1，進樣量為25卟，柱溫為30 C，柱壓為5.1 MPa，檢 測波長為260 nm。
4.3.3結果與討論
4.3.3.1聚丙烯酰胺作為營養源的探討
分別配製如下培養基。一組培養基為：在基礎培養基的基礎上添加NaN〇3 (0.2 g.L-1)，去掉酵母浸粉，以聚丙烯酰胺作為唯一碳源；一組培養基為：在基 礎培養基的基礎上添加石蠟（0.5 g.L-1)，去掉酵母浸粉以聚丙烯酰胺作為唯一氮 源；一組培養基為：在基礎培養基的基礎上去掉酵母浸粉以聚丙烯酰胺作為唯一 碳氮和氮源。每組都做空白，平行三樣。40C恒溫搖床(轉速140 rmin-1)中培養7 天後考察聚丙烯酰胺作為唯一碳源、唯一氮源和唯一碳氮源情況下，微生物對聚 丙烯酰胺的利用情況。結果如圖4-5所示：聚丙烯酰胺作為唯一氮源利用時降解
71
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
圖4-5微生物對聚丙烯酰胺作為不同營養源的利用情況 Fig.4-5 Biodegradation under the condition that HPAM served as different nutrient sources
率最高。而聚丙烯酰胺作為唯一碳氮源利用時和作為唯一碳源利用時降解率相差 不大。這說明聚丙烯酰胺既可以作為碳源也可以作為氮源被微生物利用，但優先 被作為氮源利用。被作為氮源利用的部分是其酰胺基部分。
4.3.3.2降解前後聚丙烯酰胺的變化
1)生物降解前後的聚丙烯酰胺樣品的掃描電鏡圖
聚丙烯酰胺水溶液和生物降解後的聚丙烯酰胺溶液脫水製得固體樣品，用掃 描電鏡掃描其結構變化，並與聚丙烯酰胺的固體樣品作比較，如圖4-6。聚丙烯 酰胺固體樣品（圖4-6a是一個大顆粒HPAM固體的表麵，其表麵吸附了許多小顆 粒的聚合物）和聚丙烯酰胺水溶液製得的固體樣品（圖4-6b)的表麵十分致密， 幾乎沒有孔洞，而降解之後的聚丙烯酰胺固體（圖4-6c)的表麵支離破碎，而且 有許多孔洞。說明微生物的生長代謝使聚丙烯酰胺分子斷裂為小的碎片、低聚物 或其他小分子有機物。
72
a)聚丙烯酰胺固體/HPAM Solid
b)生物降解前的樣品 / Sample before biodegradation
c)生物降解後的樣品 /Sample after biodegradation
圖4-6聚丙烯酰胺樣品的掃描電鏡圖
Fig. 4-6 The scanning electronic microscope photos of different HAPM samples
73
2)不同作用後聚丙烯酰胺的紅外光譜圖
利用紅外光譜儀測定了不同作用後聚丙烯酰胺的紅外光譜圖，比較其結構變 化。圖4-7a為聚丙烯酰胺固體、聚丙烯酰胺溶液（脫水後製得的固體樣品）、高 溫滅菌後聚丙烯酰胺溶液(脫水後製得的固體樣品）的譜圖，圖4-7b是將300mg/L 的聚丙烯酰胺溶液高溫滅菌後，一份做空白，一份用實驗室保存的聚丙烯酰胺降 解菌PM-2和PM-3降解3天，將菌體離心和脫水後製得的聚丙烯酰胺樣品和空 白中的聚丙烯酰胺（脫水後製得的固體樣品）的對比圖。
由圖4-7a可以看出聚丙烯酰胺固體、聚丙烯酰胺溶液、高溫滅菌後聚丙烯酰 胺溶液的紅外譜圖對比可以發現，後兩個樣品與聚丙烯酰胺固體的譜圖最大的區 別在3100〜3500 cm-1區域和1500〜1700 cm-1區域，其主要原因是酰胺基不同程 度的水解造成吸收峰的不同，由於酰胺基進一步水解產生羧基，其C=O伸縮振 動產生的吸收峰與聚丙烯酰胺固體譜圖中的吸收峰相比向高波數方向移動，由 1615 cm-1變為1668 cm-1和1670 cm-1。同樣由於羧基中O-H的伸縮振動的影響， 在3100〜3500 cm-1區域，聚丙烯酰胺固體譜圖中酰胺基的特征雙尖峰3381 cm-1 和3273 cm-1在後兩個樣品中已不存在，而變成比較平滑的寬峰。但聚丙烯酰胺 固體譜圖中1415 cm-1C-N伸縮振動峰和1475 cm-1N-H彎曲振動峰在後兩個樣品 依然存在，說明其酰胺基隻是部分水解，並沒有完全消失。由於後兩個樣品中含 有水分，在3600 cm-1及以上區域出現尖銳的水的O-H的伸縮振動吸收峰[92]。
由圖4-7b可以看出生物降解後的聚丙烯酰胺譜圖中C=O伸縮振動峰比降解 前向更高波數方向移動，1415 cm-1左右C-N伸縮振動峰和1475 cm-1左右N-H彎曲 振動峰已經消失，3100〜3500 cm-1區域成為一個寬大的吸收峰，這充分說明生物 降解後的樣品中酰胺基已經被微生物降解完全變成了羧基。這與Kay-Shoemake 等[87]所研究的可作為氨源被微生物利用相一致。
74
8 0000000000 987654321
1 % / 30U-1I 目 USH
,HPAM Solid HPAM Solution HAPM Solution after Sterilizing
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wave Number / cm"1
-Before biodegradation After biodegradation
00000000000
0987654321
0% / 8u^;ImsnmH
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wave Nummber / cm-1
a)水解對聚丙烯酰胺的影響/ Effect of Hydroxylation on HPAM IR Spectra
b)生物降解對聚丙烯酰胺的影響/Effect of Biodegradation on HPAM IR Spectra
圖4-7不同作用下聚丙烯酰胺紅外光譜的變化 Fig. 4-7 The change of HPAM IR spectrum under different conditions
3)生物降解前後的聚丙烯酰胺樣品的熱力學變化
對降解前後的（脫水後製得的固體樣品）樣品做了差熱曲線。測定條件：溫 度範圍為室溫到600 °C，升溫速率為5 °C/min。如圖4-8。由降解前的差熱曲線 可以看出聚丙烯酰胺在升溫過程中在410 °C和555 °C發生了兩次較大的變化。
75
變化標明兩次降解，其中第一次降解過程主要為相鄰酰 並形成酰亞胺的過程；第二次降解主要是脫氫、形成二 的聚丙烯酰胺的差熱峰就顯得比較平滑，主要原因可能 :變成了羧基，羧基的熱穩定性要比酰胺基高，所以在升
30
oo/lv
Silva等[93]研究表明兩次? 胺基之間相互縮合，脫氨 氧化碳的過程。而降解後 是降解後分子中的酰胺基 溫過程中變化較小。
10¬
0-
0100200300400500600700
Temperature / °C
-Before degradation •After degradation
圖4-8樣品降解前後的差熱分析曲線
Fig.4-8 The differential thermal analysis curve of HPAM samples before and after biodegradation
4)生物降解前後聚丙烯酰胺樣品的紫外譜圖
測定了降解前聚丙烯酰胺溶液的紫外譜圖如圖4-9。原聚丙烯酰胺溶液在紫 外波段236nm和197nm有吸收峰，這是酰胺基共軛體係和羧基共軛體係產生的紫 外吸收，而生物降解後，236nm處的吸收峰消失，說明聚丙烯酰胺的酰胺基降解 後轉化為羧基。
76
30uraqjsqv
adation
ation
200220240260280
Wavelength / nm
圖4-9樣品降解前後的紫外譜圖 Fig.4-9 The UV spectrums of HPAM samples before and a
5)生物降解前後聚丙烯酰胺的液相色譜圖
用液相色譜檢測了降解前後聚丙烯酰胺溶液的主要組
300
fter biodegradation
分的變化。為考察降解 相色譜圖（圖4-10)。 時間為 2.43 min、 4.08 、 4.08min 出現吸收峰 保留時間為 4.38 min 酰胺單體。
16000
14000
12000
310000
8000
4
3
6000
4000
2000
0
4.08
2.43
Before Biodegrad • After Biodegradat
ation
ion
,4.68
2.854.08
後是否存在丙烯酰胺單體，同時測定了丙烯酰胺樣品的液 聚丙烯酰胺原溶液在此色譜條件下有三個峰出現，其保留 min、4.68 min。降解後的樣品溶液在保留時間為2.43 min 外，在2.85min處出現一個較大的吸收峰。丙烯酰胺單體在 降解後樣品在此處無吸收峰，所以降解後樣品中不含丙烯
14
024681012
Time / min
matograms of HAPM
a生物降解前後聚丙烯酰胺溶液的液相譜圖/Liquid Chro before and after Biodegradation
77
6 8 10 12 Time / min
160004.38
14000
12000
10000
8000¬
6000
4000¬
2000
02.85 4.08
_IlL
HPAM after Biodegradation ——Acrylamide Monomer
b生物降解後聚丙烯酰胺溶液與丙烯酰胺的液相譜圖/Liquid Chromatograms of HAPM after Biodegradation and Acrylamide Monomer Formation 圖4-10生物降解前後聚丙烯酰胺的液相色譜圖 Fig.4-10 The liquid chromatograms of HPAM samples and acrylamide monomer
4.3.3.3生物降解機理的初探
聚丙烯酰胺作為一種穩定的高分子聚合材料，具有極強的生物抗性，即使是 已被降解為小分子的聚丙烯酰胺依然具有這一特征[32]。微生物分解聚合物一般 是微生物在菌體外分泌出聚合物的分解酶，分解酶再將高分子鏈分解成低分子鏈 或使其側基脫落。酶對高分子鏈的攻擊普遍在鏈端進行，即以內切的方式進行 [33]。由於細菌一般是帶有負電荷，而油田用的聚丙烯酰胺為陰離子型聚丙烯酰 胺，由於產生靜電排斥，細菌很難直接接近接近聚丙烯酰胺分子鏈，而是通過分 泌出胞外的酰胺水解酶去進攻處於側鏈的酰胺基。酰胺水解酶已被研究證實存在
於紅球菌、芽孢杆菌、分支杆菌、產堿杆菌、假單胞菌、短杆菌等很多細菌中[87]。 降解過程如圖4-11所示：
78
輔酶
C—C—C—C-
ATP
加單氧酶
小分O 〇2
子有輔酶r 11
十C C C C七
機物◄OH I
ATPCOOH
O2COOH COOH
輔酶 ATP
OH
輔酶
COOH COOH
ATP
圖4-11聚丙烯酰胺的生物降解機理 Fig 4-11 The progress of HPAM degradation by the bacteria
首先，在微生物分泌的酰胺水解酶和還原性輔酶作用下，HPAM中酰胺基 的C-N鍵被斷開，解離出NH2-離子，而該NH2-原來的位置被OH-所取代，生成 -COOH；同時，在O2的參與下，在加單氧酶的作用下進攻a位的碳原子發生a-氧 化，原來處於a位的碳原子被氧化為醇，醇進一步被氧化為醛，最後被氧化為羧 基，在此過程中，末端的碳（羧基）被移去。經過這樣一係列有各種微生物酶參 與的氧化反應，長鏈的HPAM就被斷裂成短鏈、可被微生物吸收的小分子有機物。 這些有機物以及從HPAM中解離出來的NH2-提供了微生物新陳代謝所必不可少 的碳源和氮源。整個降解HPAM的過程需要消耗大量的ATP和還原性輔酶，所以 要提供足夠的磷源[49’58]。
4. 4本章小結
在總結前人對聚丙烯酰胺降解機理研究的基礎上，探討了細菌對聚丙烯酰胺 的利用情況，結果表明聚丙烯酰胺既可以作為氮源利用也可以作為碳源利用，通 過掃描電鏡、紅外分析、差熱分析、紫外分析以及液相分析等手段對生物降解前 後的樣品的表征的基礎上對微生物好氧降解聚丙烯酰胺的機理進行了初探。在其 分泌的胞外酰胺酶的作用下聚丙烯酰胺先被作為氮源利用，在其生長和代謝過程 中，聚丙烯酰胺被斷裂為小分子有機物，又可以作為碳源被細菌利用。
79
5室內模擬實驗
在優化的實驗條件基礎上進行了室內模擬實驗研究。室內模擬實驗采用生物 接觸氧化法。
根據汙水生物處理法的原理和工藝的不同，汙水生物處理可分為[94_96]:汙水 生物處理可分活性汙泥法、生物接觸氧化法、生物轉盤法、生物流化床法、生物 氧化塘、膜生物反應器法等。
生物接觸氧化法具有BOD容積負荷高，汙泥生物量大、處理時間短、能夠 克服汙泥膨脹問題、可以間歇運轉、維護管理方便等優點成為油田汙水處理的有 效方法[97]。生物接觸氧化法是使微生物附著在載體表麵上，汙水在流經載體表 麵過程中，通過有機營養物的吸附、氧向生物膜內部的擴散以及在膜中所發生的 生物氧化等作用，對汙染物進行分解[98]。
5 1含聚汙水的水質分析及可生化性調整
為進行汙水的生物降解實驗，首先對汙水進行水質分析，在對水質分析的基 礎上對汙水進行可生化性調整。
5.1.1實驗材料與儀器
5.1.1.1主要實驗材料
菌株PM-2和PM-3、勝利油田采出水、自製生化池、溶氧氧測定管、微孔 濾膜（0.45 pm)、膜填料。
5.1.1.2主要實驗儀器
美國哈希公司 北京艾諾威商貿有限公司 日本尼康公司 日本島津
DI2500 COD快速測定儀 ET9924A BOD 測定儀 YS100顯微鏡 UV-2450型紫外分光光度計
80
保定蘭格恒流泵有限公司 廣東日生集團有限公司 玉環求精醫用儀器廠 上海山連實驗設備有限公司 北京亞泰科隆實驗科技開發中心 上海申安醫療器械廠
BT300-1J蠕動泵 ACO-003曝氣泵 XB-K-25血球計數板 SHP-150生化培養箱 YT-CJ-IND淨化工作台 LDZX-50FAS壓力蒸汽滅菌鍋
5.1.2實驗內容與方法
5.1.2.1水質分析標準及測試方法
(1)含油量測定
引用中華人民共和國石油天然氣行業標準[99]:油田汙水中石油類含量測定 方法一分光光度法（SY/T 0530-93)。
方法：石油醚萃取水中的石油類物質，利用紫外分光光度計在430 nm波長 下測定石油醚溶液的吸光度，通過標準曲線計算得到水中的含油量。
(2)懸浮固體含量測定（SS)
引用中華人民共和國國家標準[100]:水中懸浮固體的測定一重量法 (GB11901-89)。
方法：將水通過0.45 pm的濾膜，截留在濾膜上並在103-105 °C烘幹後得到 的固體物質，通過稱量，計算得到水樣中懸浮固體的含量。
(3)總氮的測定（TN)
引用中華人民共和國國家標準[101]:水質總氮的測定一堿性過硫酸鉀消解紫 外分光光度法（GB11894-89)。
在60 C以上水溶液中，過硫酸鉀可分解產生硫酸氫鉀和原子態氧，硫酸氫 鉀在溶液中離解而產生氫離子，故在氫氧化鈉的堿性介質中可促使分解過程趨於 完全。分解出的原子態氧在120-124 C條件下，可使水樣中含氮化合物的氮元素 轉化為硝酸鹽。並且在此過程中有機物同時被氧化分解。可用紫外分光光度法於 波長220和275 nm處，分別測出吸光度A220及A275，按照A=A220-2A275的值查標 準曲線並計算總氮含量。
(4)總磷的測定（TP)
81
引用中華人民共和國國家標準[102]:水質總磷的測定一鑰酸銨分光光度法 (GB11893-89)。
在中性條件下用過硫酸鉀使試樣消解，將所含磷全部氧化為正磷酸鹽。在酸 性介質中，正磷酸與鑰酸銨反應，在銻鹽存在下生成磷鑰雜多酸後，立即被抗壞 血酸還原，生成藍色的絡合物。然後用分光光度計測量溶液的吸光度值，通過標 準曲線求得總磷含量。
(5)礦化度分析
引用中華人民共和國石油天然氣行業標準[103]:油氣田水分析方法（SY/T 5523-2000)。礦化度采用重量法，直接通過水的揮發，根據剩餘物質的重量，計 算水的礦化度；另一種方法是將測得的各類主要無機離子的濃度總和作為水的礦 化度。本試驗采用第二種方法來計算水質的礦化度。
5.1.2.2含聚廢水可生化性分析及提高可生化性的實驗研究
本實驗采用醜0〇5/00〇„值評價汙水的可生化性。在一般情況下，BOD5和 C0DCT值愈大，說明汙水的可生化性愈好。可參照表5-1中所列數據評價汙水的可
生化性[104]。
表5-1汙水可生化性評價參考數據 Table 5-1 Reference of the value of biodegradability
BOD5/CODcr>0.450.3 〜0.450.2 〜0.3
可生化性較好可以較難不宜
5.1.3結果與討論 5.1.3.1化學水質分析結果
表5-2化學水質分析結果（單位mg/L, pH值除外）
Table 5-2 the result of water ananylsis (the unit, mg/L, except pH)
總礦化度總氮總磷含油量懸浮物CODCrPAMpH
107602.540.632101285952987.38
汙水中聚合物含量大約是300 mg/L，聚合物、油類物質和懸浮物共同組成
82
了穩定的體係，給汙水處理帶來了一定的困難。
5.1.3.2純聚丙烯酰胺溶液對COD的主體貢獻
配製50、100、150、200、250、300 mg/L的聚丙烯酰胺溶液，並測出各自
的CODcr值，並與理論值比較。聚丙烯酰胺的理論值計算是全部以C3H5ON形式 計算。結果如表5-3
表5-3標準聚丙烯酰胺溶液的COD&值 Table 5-3 The COD values of different HPAM solutions
HPAM 濃度(mg/L)50100150200250300
CODCr 理論(mg/L)107.04214.00321.13428.17535.20642.25
CODCr 實測(mg/L)45.2096.67160.09205.61259.53318.54
對理論值和實測值進行比較，聚丙烯酰胺作為高分子聚合物不能夠完全被重 鉻酸鉀氧化（氧化率在45 %左右），這與其較長的，並且相互交纏的分子鏈有著 較大的關係（聚丙烯酰胺分子鏈相互纏繞，並形成不同的構型）。
5.1.3.3氣浮作用對聚丙烯酰胺的影響
考察了氣浮作用對聚丙烯酰胺的濃度、粘度及CODCr貢獻的影響。聚丙烯酰 胺的濃度為300 mg/L。曝氣流量為60 L/min。由表5-4可以看出氣浮作用對於聚 丙烯酰胺的濃度影響不大而對於粘度影響較大，可能是由於長的聚合物分子鏈在 氣浮作用的剪切效應下發生斷裂，所以其粘度降低，其氧化或水解作用不明顯， 所以對濃度的影響不大，因此並沒有減少聚丙烯酰胺對CODCr的貢獻。
表5-4氣浮作用對聚丙烯酰胺溶液(300mg/L)的影響 Fig 5-4 The effect of floating on HPAM solution (300mg/L)
時間（d)135710
濃度（mg/L)301298296294289
粘度（m-Pa)6460524336
CODCr (mg/L)314.7309.5311.2304.9307.5
83
5.1.3.4聚丙烯酰胺對BOD的主體貢獻
測定了蒸餾水配製的不同聚丙烯酰胺溶液的BOD5值和添加無機營養鹽後聚 丙烯酰胺溶液的BOD5值。添加的無機營養源按選擇性培養基的配方比例添加。
由表5-5可知純HPAM溶液的BOD5值都較低，說明純HPAM溶液不容易被 微生物利用。而添加了無機營養源的HPAM溶液的BOD5有了很大程度的提高， 這也為含聚汙水的可生化性調整提供實驗基礎。
表5-5不同濃度的聚丙烯酰胺溶液的BOD5值 Table 5-5 The BOD5 values of HPAM solutions
HPAM 濃度（mg/L)50100150200250300
純HPAM溶液的BOD5值（mg/L)132230384653
添加無機營養鹽後的HPAM溶液BOD5值（mg/L)33587089100120
5.1.3.5汙水的可生化性及可生化調整
分析了汙水的可生化性結果見表5-6:
表5-6汙水可生化性分析及可生化調整結果 Table 5-6 The biodegradability analysis and adjustment of wastewater
BOD5 (mg/L)COD& (mg/L)BOD5/CODCr
含聚汙水1205160.233
可生化調整後的含聚汙水2445950.410
通過實驗得出勝坨汙水的BOD5/CODcr的值在0.3以下，根據可生化性標準， 汙水的可生化性較難，需對汙水進行可生化性調整。
由汙水的化學水質分析結果表明，汙水中的氮源和磷源嚴重不足，為了增強 微生物的活性，需外加氮源和磷源來提高廢水的可生化性。實驗采取曝氣和添加 營養（NaNO3、K2HPO4、KH2PO4、酵母浸粉等）對汙水可生化性的調整。
曝氣的作用不僅可以使汙水中底部的油和懸浮物質浮到水的表麵上，而且可 以通過降低CODcr提高BOD5/CODcr的比值，此外氣浮過程還可以向汙水中提供 微生物新陳代謝所需的氧氣，促進了微生物的活動；向汙水中加入營養可以加速
84
微生物的生長繁殖，提高微生物的活性，從而提高微生物降解有機物的能力。可 生化性調整後汙水的BOD^/CODcr的值由0.245提高到0.410,根據可生化性劃分 標準，汙水較易生化，從而可以應用生化技術進行處理。
5 2靜態模擬實驗
5.2.1實驗材料與儀器
5.2.1.1主要實驗材料
勝坨油田采出水、自製生化池、、生化池填料、菌株PM-2和PM-3。
美國哈希公司 北京艾諾威商貿有限公司 日本尼康公司 日本島津
廣東日生集團有限公司 玉環求精醫用儀器廠 上海山連實驗設備有限公司
DI2500 COD快速測定儀 ET9924A BOD 測定儀 YS100顯微鏡 UV-2450型紫外分光光度計 ACO-003曝氣泵 XB-K-25血球計數板 SHP-150生化培養箱
85
5.2.1.2主要實驗儀器
5.2.1.3實驗裝置與流程圖
圖5-1室內靜態模擬生化試驗裝置 Fig 5-1 Static simulating biological test device
5.2.2實驗內容與方法 5.2.2.1生物膜的培養與馴化
生化法處理汙水主要是依靠附著生長在填料表麵上的生物膜的氧化分解能 力，因此在運行之前必須是填料上長出生物膜，這一過程稱為掛膜。目前常用的 掛膜方式有自然掛膜法、活性汙泥掛膜法和優勢菌種掛膜法[105]。本實驗采用優 勢菌種掛膜法。
向生化池中倒入約3/4體積的汙水，加入NaNO3、K2HPO4、KH2PO4、酵母
浸粉等營養成分。曝氣一周，在此期間每天向生化池中加入已活化的PM-2和 PM-3混合菌，並定時觀察生化池中生物膜上細菌的數量。從生物膜中部剪下2 片約1 cm2的膜片，放在盛有10 mL的無菌水的血清瓶中振蕩使細菌釋放在無菌 水中。細菌的計數采用血球計數板計數法。優勢菌PM-2和PM-3的檢測采用平板 計數法。
86
5.2.2.2生物降解指標的檢測方法
對汙水中聚合物含量、含油量、COD&等指標進行檢測。檢測方法同5.1.2.1。 5.2.3結果與討論
5.2.3.1生物膜的培養與優勢菌檢測 所采用的膜填料如下圖所示：
圖5-2生物填料
Fig. 5-2 Biologic filling
向生化池汙水中按體積比例加入NaN〇3 0.2 g.L-1、K2HPO4O.5 g.L-1、KH2PO4
g-L-1、酵母浸粉0.5 g.L-1營養成分，曝氣一周，在此期間每天向生化池中加入50
mL已活化的PM-2和PM-3混合菌，並定時觀察生化池中生物膜上細菌的數量。
檢測到生物膜上的細菌如圖所示：生物膜上的細菌大多為杆菌，這與投加的 PM-2菌的形態很一致。
圖5-3生物膜上的細菌
Fig.5-3 Bacteria in membrane
運用血球計數板計數法檢測到生物膜上的細菌數如表5-7所示。
87
表5-7生物膜上的細菌隨時間的變化
Table 5-7 The change of biomass in membrane followed by the time
天數1 2 3 4 567
細菌數(107cell/cm2)1.6 3.7 5.4 6.5 7.88.58.3
由上表可以看到7天後檢測到生物膜上的細菌的密度達到大約8X107 cell/cm2,並達到穩定期。
運用平板計數法（平行5次）測得的一周後生物膜上的降解菌PM-2和PM-3 的細菌量如表5-8:
表5-8生物膜上的優勢菌量 Table 5-8 The biomass of dominant bacteria in membrane
次數12345
細菌數(107cell/cm2)4.535.56.57
平均數(107cell/cm2)5.3
一周之後生物膜上投加的降解菌的密度達到5.3X107cell/cm2,為優勢種群。 5.2.3.2生物降解的指標檢測
將馴化好的生物膜轉移到含有新加入的汙水的生化池中，加入NaNO3等營養 後，曝氣一周，期間進行聚合物含量、含油量、COD&的檢測。檢測結果如圖5-4。
Time / day
圖5-4汙水各項指標隨時間的變化 Fig.5-4 The change on content of each index with time in wastewater
由圖中數據可以看出經過3天的降解作用，出水的各項指標趨於穩定。7天
88
後，聚丙烯酰胺濃度為60 mg.L-1左右，降解率達到80 %,含油量為10 mg.L-1左 右，在生物膜的吸附以及微生物的共同作用下，原油總的去除率為95%，出水的 COD&為80 mg.L-1，COD&的總的去除率達到86 %。
5 3動態模擬實驗
5.3.1實驗材料與儀器
5.3.1.1主要實驗材料
主要實驗材料同5.2.1.1。
5.3.1.2主要實驗儀器
美國哈希公司 北京艾諾威商貿有限公司 日本尼康公司 日本島津
保定蘭格恒流泵有限公司 廣東日生集團有限公司 玉環求精醫用儀器廠 上海山連實驗設備有限公司
DI2500 COD快速測定儀 ET9924A BOD 測定儀 YS100顯微鏡 UV-2450型紫外分光光度計 BT300-1J蠕動泵 ACO-003曝氣泵 XB-K-25血球計數板 SHP-150生化培養箱
5.3.1.3實驗裝置與流程圖
裝置由氣浮池和生化池三部分組成。汙水先進入氣浮池，通過氣浮，除去大 部分的浮油和較輕的懸浮物，在蠕動泵的作用下進入生化池，在生化池中，通過 曝氣和微生物的作用，將汙水中的大部分有機物分解代謝，靜置一定時間後，出 水。
89
圖5-5動態模擬實驗裝置圖
Fig 5-5 Dynamic simulating biological test device
5.3.2實驗內容與方法 5.3.2.1生物膜的培養與馴化
生物膜的培養與馴化同5.2.2.1。
5.3.2.2生物降解指標的檢測方法
生物降解指標的檢測方法同5.2.2.2。
5.3.3結果與討論 5.3.3.1水力停留時間的確定
生物膜的培養與馴化與靜態模擬實驗中相同。在前麵考察對聚丙烯酰胺降解 時，降解菌對聚丙烯酰胺的降解率3天後基本達到一個穩定值。所以在本實驗中， 曝氣一周後，將水力停留時間逐漸縮短為3天。用平板計數法檢測生物膜上的降
90
解菌PM-2和PM-3的生物量。結果如下表：
表5-9生物膜上的生物量 Table 5-9 The biomass in membrane
次數12345
細菌數(107cell/cm2)3.5465.53
平均數(107cell/cm2)4.4
降解菌的生物量達到4.4X 107 cell/cm2
5.2.3.2生物降解的指標檢測
將馴化好的生物膜轉移到新鮮的汙水中，將水力停留時間調整為3天。在此 期間檢測出水聚合物含量、含油量、CODcr的變化。
圖5-6汙水各項指標隨時間的變化 Fig.5-6 The change on content of each index with time in wastewater
由圖中數據可以看出經過3天以後，出水的各項指標趨於穩定，聚丙烯酰胺 濃度穩定在100 mg.L-1左右，降解率達到67%，由於氣浮作用除去了大部分的浮 油，進入生化池的含油量大約在70 mg_L-1左右，在微生物的作用下，原油被降 解為15 mg-L-1左右，原油總的去除率為93 %，出水的CODcr穩定在120 mg-L-1， COD&的總的去除率達到80 %。
91
5 4本章小結
在對含聚汙水水質分析和可生化性分析的基礎上對汙水進行可生化性調整。 運用生物接觸氧化法對汙水進行了生化處理模擬實驗。模擬實驗分為靜態模擬和 動態模擬兩部分進行。結果如下：
1)靜態模擬實驗，降解7天後，聚丙烯酰胺降解率達到80%，原油總的去 除率為95 %，COD&的總的去除率達到86 %。
2)動態模擬試驗，3天以後，出水的各項指標趨於穩定，聚丙烯酰胺的降 解率達到67 %，原油總的去除率為93 %，出水的COD&總的去除率達到80 %。
92
6結論與展望 6.1結論
該論文以勝坨含聚汙水為研究對象，針對含聚汙水中聚合物含量高、含油高、 現有工藝處理困難等問題，進行了生化汙水處理技術處理含聚汙水的研究。為油 田含聚汙水的生化處理提供理論基礎。通過實驗研究，主要研究結論概括如下：
1)對本論文所用的聚丙烯酰胺的理化性質進行了測定。聚丙烯酰胺的固含量 為97.59 %，水解度為23.3 %，粘均分子量為1.71X107。對聚丙烯酰胺降解影響 因素進行了探討。pH值、光照和礦化度對聚丙烯酰胺的粘度影響較大，而對於 聚丙烯酰胺的濃度影響較小。低溫和低的機械剪切強度對聚丙烯酰胺的粘度和濃 度影響都不大，而高溫和高的機械剪切強度對聚丙烯酰胺的粘度和濃度影響都比 較大。對聚丙烯酰胺的評價方法進行了優化，以濃度評價聚丙烯酰胺降解為主， 粘度和分子量評價為輔；在濃度評價方法中采用澱粉-碘化鎘法，並對其測定條 件中的緩衝溶液的pH值進行了優化，測定的緩衝溶液的最佳pH值為3.5。
2)初步篩選到三株好氧的聚丙烯酰胺降解菌種，分別命名為PM-2、PM-3、 PM-4。通過生理生化性質和16S rDNA鑒定，PM-2為蠟樣芽胞杆菌，PM-3為枯 草芽孢杆菌，PM-4為蒼白杆菌。將三株菌進行混合正交培養後，優化出PM-2 與PM-3的混合菌降解效果最好，300 mg"L-1聚丙烯酰胺溶液的降解率最高可達到 42%。優化了混合菌降解條件，最佳降解時間為3天，連續活化次數為4次，接 種體積分數為3 %，溫度為35 - 45 °C，初始pH值為6.0 - 6.5，搖床轉速為140 r-min-1，礦化度為 2500 -10000 mg-L-1。
3)探討了細菌對聚丙烯酰胺的利用情況，結果表明聚丙烯酰胺既可以作為 氮源利用也可以作為碳源利用，通過掃描電鏡、紅外分析、差熱分析、紫外分析 以及液相分析等手段對生物降解前後的樣品的表征的基礎上對微生物好氧降解 聚丙烯酰胺的機理進行了初探。在其分泌的胞外酰胺酶的作用下聚丙烯酰胺先被 作為氮源利用，在其生長和代謝過程中，聚丙烯酰胺被斷裂為小分子有機物，又 可以作為碳源被細菌利用。
4)在對含聚汙水水質分析和可生化性分析的基礎上對汙水進行可生化性調
93
整。運用生物接觸氧化法對汙水進行了生化處理模擬實驗。模擬實驗分為靜態模 擬和動態模擬兩部分進行。靜態模擬實驗中，降解7天後，聚丙烯酰胺降解率達 到80 %，原油總的去除率為95 %，COD&的總的去除率達到86 %。動態模擬 試驗中，生化處理3天以後，出水的各項指標趨於穩定，聚丙烯酰胺的降解率達 到67 %，原油總的去除率為93 %，出水的COD&總的去除率達到80 %。
6.2存在問題及展望
由於時間及實驗條件的限製，論文中還存在一些不足之處，需要在以後工 作中進一步完善，具體如下：
1)論文中微生物降解聚丙烯酰胺的機理有待於更深入的探討，所以結合氣 質聯用、核磁共振技術加強對代謝產物的分析，有助於深入探討微生物對聚丙烯 酰胺的降解機理。複合菌因可能具有協調機製，具有較高降解效果，但具體的機 製尚未清楚，研究其協調機製將是下一步實驗探索的重點。
2)為考察細菌在汙水中的生長繁殖情況，本文中采用傳統的鏡檢法和絕跡 稀釋法檢測生物量，此方法繁瑣耗時且精確度較差；為準確跟蹤細菌在生化池中 的生長繁殖情況可采用PCR-DGGE (聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳）和 T-RFLP (末端限製性酶切片段長度多態性）技術對水中微生物進行跟蹤、監控。
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