改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究：
改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究，利用自製的改性聚丙烯酰胺為(wei) 載體(ti) 包埋苯酚降解菌，考查了該載體(ti) 對細胞性能的影響，比較了 4種固定化方 法——改性聚丙烯酰胺法、聚丙烯酰胺法、海藻酸鈣法和聚乙烯醇■海藻酸鈣法包埋微生物細胞的優(you) 劣。實驗結果表明，單 體(ti) 丙烯酰胺經改性後製得的改性聚丙烯酰胺對微生物細胞活性無影響。以其為(wei) 載體(ti) 固定苯酚降解菌，其細胞相對活性比 聚丙烯酰胺法高出了 42 4%;比海藻酸鈣法高出了 16 4%;比聚乙烯醇■海藻酸鈣法高出了 44 3%,表明改性聚丙烯酰胺包 埋細胞更有利於(yu) 細胞的增殖和活性恢複。重複應用實驗表明，改性聚丙烯酰胺法得到的細胞凝膠，機械強度好，有彈性，可 多次重複利用。改性聚丙烯酰胺作為(wei) 細胞固定化載體(ti) 其優(you) 點是交聯速度快、聚合放熱溫度低、在側(ce) 鏈發生交聯反應、抗水 解能力強、無毒、凝膠壽命長。
微生物細胞固定化方法中，以包埋法最為常用。 作為包埋載體，天然高分子多糖類的海藻酸鈉和卡 拉膠應用最多，它們具有固化、成型方便，對微生物 毒性小及固定化密度高等優點。但它們抗微生物分 解性能較差，機械強度較低、使用壽命短。這兩種載 體的凝膠雖然可以用交聯劑進行穩定化處理，但活 性和傳質性能又會下降。合成高分子化合物中常用 的載體物質有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光硬化樹脂
強度高，化學性能穩定。但是聚合物網絡的形成條 件比較劇烈，對微生物細胞的損害較大 。尤其是 聚丙烯酰胺作為微生物細胞包埋固定化載體，雖然 其機械強度、化學穩定性、抗微生物分解性能及價格
低廉等都優於其他合成高分子載體，但因其單體丙 烯酰胺的細胞毒性、環境毒性、聚合反應時間長、聚 合溫度高等問題，嚴重影響了其在食品、製藥、環保、 新能源開發及化學合成等領域固定化微生物細胞或 固定化酶的使用。本研究以改性聚丙烯酰胺、聚丙 烯酰胺、海藻酸鈉和聚乙烯醇為載體，對苯酚降解菌 進行包埋，考察改性聚丙烯酰胺載體對細胞性能的 影響。為該載體的進一步開發和應用奠定理論 基礎。
1材料與方法
11實驗藥品
丙烯酰胺（AM)、甲醛、三乙胺、過硫酸銨、N，N- 亞甲基雙丙烯酰胺、N，N，NC NC四甲基乙二胺、甲 酸鈉、海藻酸鈉、聚乙烯醇、苯酚、4氨基安替比林 (均為分析純），苯酚降解菌NT-1(沈陽化工學院生 物工程實驗室保藏菌種）。
1 2室溫交聯聚丙烯酰胺的合成方法
將計量的丙烯酰胺單體水溶液、甲酸鈉、過硫酸 銨放入反應器中，升溫並恒定在一定溫度，反應一定 時間，得到低分子量的聚丙烯酰胺[2]。向低分子量 聚丙烯酰胺溶液中加入計量的甲醛溶液，調節pH 值，加熱並恒定在一定溫度，反應一定時間，得到 N-羥甲基化聚丙烯酰胺。然後調節溫度，加入與甲 醛等摩爾的丙烯酰胺，恒溫反應一定時間後，得到改 性聚丙烯酰胺溶液。改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究，其低分子量聚丙烯酰胺、甲醛、 單體丙烯酰胺的質量比為1: 0. 6: 0. 6改性聚丙烯 酰胺的固含量為12. 98%。
1 3苯酚降解菌NT-1菌懸液的製備
從苯酚降解菌NT-1斜麵挑取菌台兩環接種到 50mL苯酚濃度為200mg/L的無機鹽培養液中，在 溫度為30°C，轉速為120 r/min的條件下振蕩培養 24 h後，將培養液在7 000 r/mh條件下離心10 min倒去上清液後，倒入適量的無機鹽培養液，製成 一定濃度的菌懸液備用。
1 4細胞固定化方法
改性聚丙烯酰胺法：按文獻[4]取一定量的改 性聚丙烯酰胺，按2% (V/V)的比例加入配製好的 菌懸液（OD380 = 0■ 500)與之充分混勻，按配比依次 加入N，NC亞甲基雙丙烯酰胺、N，N，NC NC四甲基 乙二胺、過硫酸銨溶液混勻，室溫下靜置3~ 5 min， 即得到固定化細胞凝膠。使用前將其切成粒徑約為
聚丙烯酰胺法、聚乙烯醇-海藻酸鈣法和海藻酸 鈣法分別按文獻[5]、[ 6]的方法製備固定化細胞凝 膠，固定化細胞量與改性聚丙烯酰胺法相同。
15苯酚降解實驗[3]
250mL三角瓶裝苯酚含量為400mg/L的無機
鹽培養液50 mL，加入上述固定化細胞凝膠或與該 固定化細胞凝膠固定菌量相同的遊離菌體，在 30 °C、120 r/mh的搖床上振蕩培養，定時測定苯酚 濃度，計算苯酚降解率。苯酚濃度的測定采用4氨 基安替比林直接光度法。待苯酚降解率超過90% 後，濾出固定化細胞凝膠，用蒸餾水清洗後進行下一 批次的苯酚降解實驗。
2結果與討論
21固定化載體及固定化方法對細胞活性的影
響[17]
2 1 1改性聚丙烯酰胺與單體丙烯酰胺對細胞活 性影響的比較
取0.1 mL菌懸液加入到5mL不同濃度的固定 化載體水溶液中浸泡，其作用時間與完成固定化過 程所需的時間相同，然後將其加入到苯酚無機鹽溶 液中，按1 5所述的實驗方法進行苯酚降解實驗，同 時以不加菌懸液的5 mL不同濃度的固定化載體水 溶液為對照，每組設3個重複實驗。2 h後取樣測定 苯酚濃度，取其平均值計算苯酚降解率，以苯酚降解 率表示該反應體係中細胞的活性。結果見表1。
表1改性聚丙烯酰胺與單體丙烯酰胺對微生物活性的影響 Table1 Effect ofmodified polyacrylsm ide and
acrylamide monomer on m crobial activity
改性聚丙烯酰胺濃度（％ )單體丙烯酰胺濃度（％ )
0 5 9 130 5 9 13
細胞相對 活性（％ )*丄⑴ 100 100 100100 52 9 31 4 19 6
*細胞相對活性（％)=(固定化材料中細胞活性/遊離細胞活 性）@ 100%
表1的結果表明：改性聚丙烯酰胺對微生物細 胞活性無影響，改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究，而單體丙烯酰胺對微生物細胞的活 性有強烈的抑製作用。當單體丙烯酰胺的濃度為 5%時，細胞的相對活性為52. 9%，隨著單體丙烯酰 胺濃度的増大，細胞的相對活性在逐漸的減小，當濃 度為13%時，細胞的相對活性僅為19. 6%。說明單
大。而改性聚丙烯酰胺對細胞無毒性。
2 1 2 4種固定化方法對細胞活性的影響
按照1 4所述的實驗方法包埋NT-1苯酚降解 菌，取0. 1 mL苯酚降解菌的菌懸液和含有Q 1 mL 苯酚降解菌的固定化細胞凝膠及等量的不含菌的固 定化凝膠按1.5所述的實驗方法進行苯酚降解實 驗，每組設3個重複實驗。2 h後取樣測定苯酚濃 度，取其平均值計算苯酚降解率，以苯酚降解率表示 該反應體係中細胞的活性。結果見表2„
表2 4種固定化方法對細胞活性的影響
Table 2 Effect of four mmobilization methods on cells activity
固定化方法改性聚丙烯 酰胺法聚丙烯
酰胺法海藻
酸鈣法聚乙烯醇- 海藻酸鈣法
固定化細胞 相對活性（％ )*78. 836. 462 434 5
固定化時間（min)3~ 51801 4401 440
*固定化細胞相對活性（％)=(固定化細胞活性/遊離細胞活 性）@ 100%
表2的結果表明:不同的包埋方法對細胞活性 的影響不同。用改性聚丙烯酰胺法固定的微生物細 胞，其相對活性最高，為78. 8%，比聚丙烯酰胺法高 出了 42.4%，比海藻酸鈣法高出16. 4%。同時固定 化操作容易，固定化時間短。在包埋實驗中由於所 製備的固定化細胞凝膠量較少，因此交聯放熱少、散 熱快，聚合熱對微生物活性的影響沒有體現出來。 如果考慮聚合熱對微生物活性的影響，則改性聚丙 烯酰胺法能更優於聚丙烯酰胺法。因為改性聚丙烯 酰胺的交聯點是在聚丙烯酰胺的側鏈上，隻是交聯 劑和側鏈丙烯酰胺基團的聚合反應，因此聚合溫度 接近室溫。
2 2固定化細胞凝膠的重複使用效果
按照1 4所述的實驗方法包埋NT-1苯酚降解 菌，改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究，取含有0. 1mL苯酚降解菌的固定化細胞凝膠按 1. 5所述的實驗方法進行苯酚降解實驗，每組設兩 個重複實驗。定時取樣測定苯酚含量，至苯酚降解 率達90%以上即可更換批次。每次更換時，先將培 養液倒淨，再將固定化凝膠用蒸餾水衝洗後倒入幹 淨的三角瓶中，加入新鮮的苯酚無機鹽培養液，重複 上述實驗過程。實驗結果見表3〇
表3 4種固定化細胞凝膠的重複使用效果比較 Table 3 Comparison of reuse effects of four mmobilized cellgels
重複使用批次
123456
降解時間（h)271512101010
改性聚丙烯酰胺法
苯酚降解率（％)96 3494. 7593. 5695 3595 9596 14
降解時間（h)463016131313
聚丙烯酰胺法
苯酚降解率（％)96 7493 5692. 3794. 1694. 9595 15
降解時間（h)301814121212
海藻酸鈣法
苯酚降解率（％)94. 0092 8193. 8094. 4094. 7995 39
降解時間（h)483518151515
聚乙烯醇■海藻酸鈣法
苯酚降解率（％)92 8193 4093. 8093 4093 8094. 20
細胞經過固定化後沒有進行細胞増殖培養和活 性恢複，直接加入到苯酚無機鹽培養液中進行降解 實驗，在降解實驗的過程中完成細胞的増殖和活性 恢複。從表3結果可以看出：4種固定化方法對細 胞増殖及活性的影響有很大差別。在相同的實驗條 件下，要使載體內的細胞増殖和活性恢複達到穩定 狀態，改性聚丙烯酰胺法需要54 h聚丙烯酰胺法需 要92 h海藻酸鈣法需要62 h聚乙烯醇-海藻酸鈣 法需要109 h在第1批次的實驗中，要使苯酚降解
率達96%以上，改性聚丙烯酰胺法比聚丙烯酰胺法 少用了 19 h，比海藻酸鈣法少用了 3 h多，比聚乙烯 醇-海藻酸鈣法少用了 20 h多。說明改性聚丙烯酰 胺法對細胞的増殖和活性影響較小。改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究，經過3個批次 的重複實驗後，4種固定化方法的細胞増殖和細胞 降解性能基本穩定。固定化細胞凝膠中的細胞増殖 及性能穩定後要使苯酚降解率達93%以上，改性聚 丙烯酰胺法比聚丙烯酰胺法少用了 3 h多，比海藻
了 5h多。這進一步說明改性聚丙烯酰胺法不但對 細胞的增殖和活性影響較小，可能載體的孔容也要 大於其他3種包埋方法，使得改性聚丙烯酰胺固定 化細胞降解苯酚的速率明顯高於其他3種固定化細 胞方法。而且使用6批次後，改性聚丙烯酰胺細胞 凝膠顆粒和聚丙烯酰胺細胞凝膠顆粒的彈性和硬度 無多大變化，而聚乙烯醇-海藻酸鈣細胞凝膠顆粒則 膨脹、變軟並粘連到一起，海藻酸鈣細胞凝膠小球有 部分破損。將使用6批次後的改性聚丙烯酰胺細胞 凝膠保存在無機鹽培養液中，在室溫下和4 °C冰箱 中貯藏，並分別於3個月、6個月、10個月後進行苯 酚降解實驗。結果表明細胞的活性及增殖能力能很 快恢複，凝膠的強度及彈性基本無變化。說明改性 聚丙烯酰胺凝膠機械強度好，壽命長，可多次重複 使用。
2 3改性聚丙烯酰胺固定化細胞與遊離細胞降解 苯酚的比較研究
胞起到了保護作用，使其免受苯酚的毒害。因為在 固定化係統中，苯酚需擴散進入載體內部，才能得到 包埋在載體內微生物細胞的分解，擴散作用使得苯 酚濃度從載體外部到內部由高到低，形成濃度梯度， 減輕了有毒物質對載體內微生物的毒性。同時，載 體內部具有較大的孔隙度，可以容納不斷增殖的細 胞，致使載體內細胞不斷利用水中的苯酚進行繁殖, 增大細胞密度。因此，使得固定化細胞降解苯酚的 速率與遊離細胞相比得以較大幅度的提高。
3結論
單體丙烯酰胺經改性後製得的改性聚丙烯酰胺 對微生物細胞活性無影響。以改性聚丙烯酰胺為載 體固定微生物細胞，其細胞相對活性比聚丙烯酰胺 法高出了 42.4%;比海藻酸鈣法高出了 16. 4%;比 聚乙烯醇-海藻酸鈣法高出了 44 3% ,進一步表明改 性聚丙烯酰胺包埋細胞更有利於細胞的增殖和活性
將改性聚丙烯酰胺固定化細胞凝膠（含菌懸液恢複。改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究，固定化細胞凝膠重複使用實驗表明，改性聚 0. 1mL)和與該固定化細胞凝膠固定菌量相同的遊丙烯酰胺法得到的細胞凝膠，機械強度好，有彈性， 離菌體分別置於50 m!、苯酚初始濃度分別為可多次重複利用。因此，改性聚丙烯酰胺可以作為 400mg/L和800mg/L的無機鹽培養液中，於30°C、固定化細胞的載體。其優點是固定化操作簡單、交
洱7. (X 120 r/m in條件下振蕩培養。對比固定化細
胞和遊離細胞對苯酚的降解情況，結果如圖1所示。
圖1改性聚丙烯酰胺固定化細胞與遊離細胞 降解苯酚的比較
F g 1 Comparison of phenol degradati)n by modified p〇]kracr^r]amide and free cell
聯速度快、聚合放熱溫度低、對細胞的毒性和損害 小、抗水解能力強、機械性能好及使用壽命長等。改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究，該 載體的開發將為食品、製藥、環保、新能源開發及化 學合成等領域固定化微生物細胞或固定化酶的製備 技術探索一條新路。
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