活性汙泥中細菌對聚丙烯酰胺的生物降解研究：
活性汙泥中細菌對聚丙烯酰胺的生物降解研究，聚丙烯酰胺(P〇lyacrylamide，PAM)是一類重要的水溶性高分子聚合物，已廣泛應用到工農業生產的各個領域和人們的日 常生活中。同時，PAM在環境中的殘留、迀移和降解對環境的汙染也日趨嚴重，尤其是降解後的單體丙烯酰胺對人類的神經係統有 很大的危害。本文從勝利油田的活性汙泥中篩選出3株聚丙烯酰胺降解菌，通過比較篩選出一株降解效果較好的菌，命名為AS-2。 根據生理生化特性分析，初步鑒定為海球菌屬。采用室內培養方法，研究了 AS-2對聚丙烯酰胺生物降解的最佳條件。結果表明，當 降解時間為5d，pH=8,溫度為40^，碳源為原油，氮源為NaN〇3,原油和NaN〇3的含量分別為2.5，1.4giL-1時，AS-2對聚丙烯酰胺 的降解率達到45.23%。通過對聚丙烯酰胺生物降解前後的紅外譜圖比較，推斷出AS-2主要降解了聚丙烯酰胺側鏈的酰胺基，將酰 胺基降解為羧酸和遊離的氨基。用高效液相色譜檢測生化後的PAM溶液，未檢測出單體丙烯酰胺。
聚丙烯酰胺(Polyacrylamide, PAM)是丙烯酰胺及 其衍生物的均聚物和共聚物的統稱，為線性水溶性高 分子的一種，親水性高，能以各種百分比溶於水，不溶於大多數有機溶劑。它是應用最廣泛的水溶性高分子 化合物之一，並享有“百業助劑”之稱[1]，不僅己廣泛應 用在石油開采、水處理、紡織、造紙、製糖、選礦、醫藥、 建材、農業等領域，而且在食品、藥品以及整容等與人 們日常生活和人類健康相關的領域也都有應用。
在我國，聚丙烯酰胺的消費現狀為:采油工業是 第一大用戶，占總需求量的80%左右，第二位是水處 理，約占9%，造紙占5%，礦山占2%，其他占3%。在 采油工業中，聚合物驅油3次采油技術己進入大麵積。
工業化推廣應用階段[2]。聚合物幹粉年注入量己達萬 噸以上，預計到2010年，我國石油開采行業PAM需 求量為10~11萬t，占總需求量的80%左右，其規模 在世界處於遙遙領先地位[3]。伴隨而來的是大量含有 一定濃度及保留一定黏度的聚合物產出水，大慶油田 有些采油廠采出水中PAM的濃度己經高達1 000 mg • L-1以上[4]。含聚丙烯酰胺(PAM)汙水中殘留單體丙烯 酰胺(AM)的毒性很大[5]，如直接排放，將在環境中逐 漸積累，危害環境，然而現有工藝無法滿足處理要求， 需要對PAM降解的途徑和機理進行全麵深入的研 究，尋找合適的處理方法。
本文從勝利油田的活性汙泥中初步篩選到3株 聚丙烯酰胺降解菌，通過探索性實驗篩選出適合微生 物降解聚丙烯酰胺的優化條件。
1材料與方法
1.1實驗儀器
DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器、SHP-150生化 培養箱、LDZX-50FAS立式電熱壓力蒸汽滅菌器、 YS100顯微鏡、721型分光光度計、pH計、紅外光譜儀 (AVATER360FT-IR)、高效液相色譜儀(AgilentllOO)。
1.2培養基
基礎培養基(g‘L-):蛋白腖5,牛肉膏10，NaCl5。 去離子水1 000 mL。
降解培養基L-):聚丙烯酰胺0.3,葡萄糖2, NaNO31，KH2PO41.5，K2HPO41.5，MgSO4 0.5。去離子水 1 000 mL。
1.3 菌株的篩選和分離
活性汙泥中許多微生物接觸一段時間後才具備 降解抑製物的能力，因此需對汙泥進行馴化。將100 mL勝利油田的活性汙泥加到盛有1 000 mL的基礎培 養基的燒杯中，置於(35±1)丈的恒溫槽中，用魚缸充 氣器進行曝氣。先培養活化3d後，每72 h更換1次 混合液，逐步増加含聚汙水的濃度(聚丙烯酰胺濃度： 50~500 mg. L-)，培養馴化45 d後進行細菌分離。
用平板劃線法分離細菌，將平板置於37丈的生 化培養箱中培養48 h後，再挑取不同形態的菌落進 行平板劃線純化細菌。根據菌落形態和顯微鏡觀察結 果，重複劃線分離，直到得到純細菌。然後再對篩選出 的菌種進行生理生化鑒定。
1.4分析方法
1.4.1聚丙烯酰胺質量濃度測定
采用濁度法。生物降解率n (%)的表達式為：
n= (C0-C) /C0X100%
式中:C。表示降解前的聚丙烯酰胺含量，mg^L-1; C1表 示降解後的聚丙烯酰胺含量，mg • L-1。
1.4.2紅外光譜分析
聚丙烯酰胺幹粉和微生物降解產物，用光譜純 KBr壓片後進行紅外光譜分析。
1.4.3高效液相色譜分析
色譜條件:Agilent ZORBAX XDB-C18 柱（3.0 mm x250 mmx5|xm);流動相為Mili-Q水；流速為0.4 mL-min-1;紫外196 nm處監測;進樣量為50 |xL。此方 法對丙烯酰胺的檢測靈敏度為ppb級[6]。
2結果與討論
2.1 細菌的篩選和鑒定
從勝利油田的活性汙泥中篩選到3株聚丙烯酰 胺好氧降解菌，活性汙泥中細菌對聚丙烯酰胺的生物降解研究，分別命名為AS-1、AS-2和AS-3。根 據形態觀察和生理生化鑒定，初步鑒定為:AS-1為脂 肪杆菌屬，AS-2為海球菌屬，AS-3為動性球菌屬。
2.2細菌的生長曲線測定
測定細菌生長曲線了解其生長繁殖規律，這對有 效地利用和控製細菌的生長具有重要的意義。在適宜 的條件下，培養細菌要經曆延遲期、對數期、穩定期和 衰亡期4個階段。
采用濁度法分別測定了 AS-1、AS-2和AS-3以 及混合菌在降解培養基中的生長曲線，結果見圖1。 從圖中可以看出，3株菌和混合菌在前5 h內生長緩 慢，處於生長的延遲期。5 h後細菌濃度大大増加，開 始進入細菌的生長對數期。11 h後，細菌的生長又開 始趨向平緩，這時進入了穩定期，持續一定時間後，細 菌濃度開始減少，進入衰亡期。其中菌株AS-2的生
圖I單株菌和混合菌的生長曲線
Kijiurt* I Hu* gniwth curvuture> of single Imcl^riniii ami mixed nactcriu
長較快，細菌濃度較大，是優勢菌種。
2.3單株菌和混合菌的降解能力比較
環境汙染物的降解有時可通過單株細菌完成，有 時也需要多株細菌間的協作來完成的。同時多株菌共 存可能存在協同作用，提高單株菌對降解物的降解效 果，也可能存在桔抗作用，降低單株菌對降解物的降 解效果。所以，將3株菌正交混合後在降解培養基中 培養，考察對聚丙烯酰胺的降解效果，結果見圖2。
圖2單株菌和混合菌的降解能力的比較
Figure 2 Tilt* romparismi of degrailution rales of single huctt'rium anti mixed hactrria
不同菌株對聚丙烯酰胺的降解能力存在差異，菌 株AS-2的降解效果最好，菌AS-1和AS-3對聚丙烯 酰胺的降解效果不明顯，並且菌AS-1和AS-3對菌 AS-2有明顯的桔抗作用。混合培養的降解效果都不如 單株菌AS-2的降解效果。所以菌AS-2為降解聚丙烯 酰胺的優勢菌，在後續的實驗中對其作深入研究。
2.4菌AS-2降解聚丙烯酰胺的條件優化 2.4.1最佳反應時間的確定
將菌AS-2接入250 mL的降解培養基中，在37 丈，140 •min-1的恒溫搖床中振蕩培養，間隔一定的 時間測定聚丙烯酰胺的濃度。
從圖3可以看出，在前5 d內，菌AS-2對聚丙烯 酰胺的降解效果明顯，在第5 d的時候，聚丙烯酰胺 的降解率達到40.51%。而後，隨著降解時間的延長， 聚丙烯酰胺降解率増長緩慢。這可能是菌AS-2的代 謝產物所致。由於過長的降解時間不但増加處理成 本，而且不利於實際應用。所以，活性汙泥中細菌對聚丙烯酰胺的生物降解研究，選取菌AS-2降解聚 丙烯酰胺的最佳時間為5 d。
2.4.2初始pH的確定
不同的微生物有其最適宜的生長pH值範圍，同 一微生物在其不同的生長階段和不同的生理、生化過 程中，也要求不同的最適宜的pH值。將菌AS-2接入 降解培養基中，分別將pH值調為2、3、4、5、5.5、6、
6.5、7、7.5、8、8.5、9。在 35 U 140 r.min-1 的恒溫搖床
中振蕩培養5 d後測定聚丙烯酰胺的濃度。實驗結果 見圖 4。
從圖4可以看出，不同的初始pH值對聚丙烯酰 胺的降解有較大的影響。pH值在7~8之間時，聚丙烯 酰胺的降解效果較好。降低或増大pH值，聚丙烯酰 胺的降解率都減小。當pH=8時，聚丙烯酰胺的降解 率最高，達到33.29%。
2.4.3溫度的確定
將菌AS-2接入降解培養基中，溫度範圍為25~ 55丈，pH=8，靜置培養4 d後測定聚丙烯酰胺的濃 度。溫度對聚丙烯酰胺降解率的影響見圖5。當溫度 為30~45丈時，AS-2對聚丙烯酰胺的降解效果較好， 在40丈時，聚丙烯酰胺的降解效果達到最好，降解率 達到32.25%。繼續升高溫度，聚丙烯酰胺的降解率大 幅度下降。所以，40丈為最佳降解溫度。
2.4.4最佳碳源的確定
分別選取了 NaHC〇3、乙酸鈉、橄欖油、可溶性澱 粉、原油、葡萄糖、蔗糖為碳源，其含量均為2 gl-1，
^/sy 工cmJcl-scsitrK
25303540455055
Teni|K*ra!urf*Ai
圖5溫度對降解率的影響
Figure 5 Hit* efferl of lempfratun* on dep'adution rulers
2.4.5最佳氮源的選擇
分別選取了 NaN〇3、尿素、硫酸銨、蛋白腖、NH4CI 為碳源，其含量均為1g.L-1，pH為8,在37丈、140r- min-1的恒溫搖床中振蕩培養5d後測定聚丙烯酰胺的 含量。從圖7可以看出，氮源為NaN〇3時，菌AS-2對 聚丙烯酰胺的降解效果最好，降解率達到43.75%。 2.4.6碳源、氮源含量的確定
分別考察了原油和硝酸鈉含量對菌AS-2降解 聚丙烯酰胺的影響(結果見圖8,圖9)。實驗表明，當 原油含量為2.5 g-L-1，硝酸鈉含量為1.4 g-L-1時，菌 AS-2對聚丙烯酰胺的降解效果最好，分別達到了 33.83%和 45.23%。
pH為8,在37140 r.min-1的恒溫搖床中振蕩培養
5 d後測定聚丙烯酰胺的含量。從圖6可以看出，活性汙泥中細菌對聚丙烯酰胺的生物降解研究，碳源 為葡萄糖時，菌AS-2對聚丙烯酰胺的降解效果最 好，降解率達到40.73%，碳源為原油時，降解率較低， 為29.70%。但油田的含聚汙水中同時也含有原油，所 以從實際應用考慮，選取原油為碳源。
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圖7氮源種類對降解率的影響
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圖8碳源含置對降解率的影響
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圖9氮源含置對聚丙烯®胺的影響
Figiirt* 9 Tlie effecl of NaNO^ content on degradation rat«»s
3菌AS-2對聚丙烯酰胺結構的影響
分別對聚丙烯酰胺降解前後的樣品進行了紅外 掃描（圖10、圖11)。從圖中可以看出，活性汙泥中細菌對聚丙烯酰胺的生物降解研究，經過菌AS-2 降解後的聚丙烯酰胺的紅外光譜圖發生了明顯的變 化。降解後聚丙烯酰胺的譜圖中的3 300~3 500 cm-1 處附近-NH2的伸縮性振動特征吸收峰明顯變弱，說 明了微生物主要降解了聚丙烯酰胺側鏈上的酰胺基。 根據1 364 cm-1和920 cm-1附近出現新的吸收峰，可
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降解前降解後
圖丨(）微生物降解前後的聚丙烯酰胺的紅外光譜
Figure 10 Hie IK nidiire of PAM before xind after liifNlpgmdatinn
以確定體係中的羧基的存在。1462cm-1處的峰消失和 1082 cm-1處的峰明顯變寬變強，活性汙泥中細菌對聚丙烯酰胺的生物降解研究，說明氨基可能從聚 丙烯酰胺側鏈上脫落下來成為遊離的氨基。同時， 530~995 cm-1處出現的幾個強的吸收峰代表了芳香 化合物，可能是微生物的代謝產物。所以，可以推斷菌 AS-2主要降解了聚丙烯酰胺的側鏈，把酰胺基降解 成了羧酸和遊離的氨基。
4丙烯酰胺單體的測定
聚丙烯酰胺本身基本無毒，但是它的單體，丙烯 酰胺(Acrylamide, AM)的毒性卻很強，它是神經係統
致毒劑，對神經係統有損傷作用，中毒後表現為肌體 無力和運動失調等症狀[7]。因此，在PAM的使用過程 中人們非常關注是否有單體釋放出來。本文用高效液 相色譜法考察了生化過程中是否有丙烯酰胺單體產 生（圖11、圖12)。
從圖中可以看出，丙烯酰胺標樣的保留時間為 3.227 min，活性汙泥中細菌對聚丙烯酰胺的生物降解研究，而降解後的PAM溶液的3個峰的保留時 間分別為1.902、2.715、2.929 min均不在丙烯酰胺出
峰處。說明經生化處理後的PAM溶液中沒有丙烯酰 胺單體生成。用高效液相色譜檢測生化後的PAM溶 液，未檢測出單體丙烯酰胺。
5結論
(1)從勝利油田的活性汙泥中篩選出3株聚丙烯 酰胺降解菌，通過比較篩選出一株降解效果較好的菌 AS-2。研究了 AS-2對聚丙烯酰胺生物降解的最佳條 件。結果表明，當降解時間為5 d、pH=8、溫度為40 丈、碳源為原油、氮源為NaN〇3、原油和NaN〇3的含量 分別為2.5、1.4 g，L-1時，AS-2對聚丙烯酰胺的降解 率達到45.23%。
(2)分別對聚丙烯酰胺降解前後的樣品進行了紅 外掃描。經過菌AS-2降解後的聚丙烯酰胺的紅外光 譜圖發生了明顯的變化。經過紅外分析，可以推斷菌 AS-2主要降解了聚丙烯酰胺的側鏈，把酰胺基降解 成了羧酸和遊離的氨基。結果表明，菌AS-2對聚丙 烯酰胺具有較強的生物降解功能。用高效液相色譜檢 測生化後的PAM溶液，未檢測出單體丙烯酰胺。
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