聚丙烯酰胺（Polyacrylamide,簡稱PAM)是丙烯酰

胺（Acrylamide，簡稱AM)均聚物和共聚物的統稱。由 於其具有良好的絮凝性能，目前仍是中國及國外用量最 大的水處理劑[1]。到2005年，PAM世界年總需求量為65 萬t，且以每年10°%的速率遞增，用在水處理領域的比例 為39°%[2]。到2007年，僅中國PAM生產總量從2000年 的10萬t上升到了 49萬t，而用在水處理領域的比例從 2005 的 9%增長到 25%[3]。

PAM在過去一直被認為是穩定、安全、無毒的。事 實上，進入環境中PAM在化學、物理及生物因素的作用 下，最終會生成各種低聚物以及AM單體。已有的研究 表明，AM具有較強的神經毒性和致癌作用[4]，許多國家 都已建立了 AM的標準限值相關的規定[5-6]。因此，可以 推斷PAM可能會對其所排放環境中的生物造成潛在的威 脅。目前，關於PAM的研究多集中在其合成技術、新產 品開發和應用方麵。雖然中國及國外關於PAM在進入環 境中的變化已有一些研究[7-8]，但都集中在降解方式和降解機理方麵，而關於PAM對土壤生物和環境的不利影響 幾乎是空白。

隨著世界各國城市汙水處理設施的逐步完善，汙泥 產生量也在迅猛增長。就中國而言，預計到2010年，汙 泥產量將達到2.85X107 t (含水率80%) [9]，汙泥處置已 成為一個十分緊迫的問題。城市汙泥蚯蚓生物轉化技術 (Vermicomposting)因其具有經濟環保的特點，從20世紀 70年代就被研究並應用[1。-11]，而目前的研究主要集中在技 術可行性[12-13]以及技術應用過程中汙泥的理化性質[14]及 其中的營養成分[15]、重金屬[16]、有機汙染物[17]、微生物[18] 等方麵的變化，但是有關汙泥中PAM對蚯蚓以及所排放 環境的影響還未見報道。前期的研究表明，汙水處理過程 中所使用的PAM有60%〜70%殘留到汙泥中，其使用對 汙泥的理化性質也有一定的影響[19]。因此，本文采用人 工土壤培養方法，對PAM和AM對蚯蚓的存活、生長、 繁殖能力的急性和亞急性毒性效應進行研究，為評價 PAM在汙泥蚯蚓堆肥處置過程中對蚯蚓的影響以及 PAM的潛在環境風險提供基礎數據，進而為蚯蚓生物轉 化技術的改進以及PAM安全使用和管理提供數據支持。

1材料和方法

1.1受試蚯蚓及試劑

選用由北京龍威昌生物科技有限公司提供的赤子愛 勝蚓（Eiseniafetida)，並在實驗室用牛糞作為基質進行 培養。試驗挑選3月齡以上，具有明顯環帶的健康蚯蚓， 體長5〜6 cm，體重0.25〜0.50 g。試驗前蚯蚓需在人工 土中馴化至少24 h。

PAM由北京希濤技術開發有限公司提供，顆粒狀固 

體，固含量彡90.0%，丙烯酰胺含量彡0.05%，AM,白色

粉狀晶體，化學純，由山東寶莫生物化工股份有限公司

生產。

1.2試驗土壤

試驗用人工土壤按照粒徑<2.0 mm石英砂70°%，高 嶺土 20°%，長度彡15 mm草炭土 10°%的質量比配製而成， 然後通過添加適當的碳酸鈣將pH值調節為6.0士 0.5[20-21]。土壤最大持水率根據ISO標準程序進行測定[22]， 將人工土在水中浸泡3 h然後再排幹2 h測得人工土 的最大持水率為65% (w/w)。

1.3試驗方法 1.3.1急性毒性試驗

PAM和AM用蒸餾水溶解後，均勻拌入到500 g人 工土壤中，PAM的濃度分別為0、50、250、500、1000、 2 000 和 4 000 mg/kg，AM 的濃度分別為 0、25、100、200、 400和800 mg/kg,用蒸館水調節土壤含水率到60°%(w/w)

左右。每一個處理設3個重複，同時設空白對照。

將準備好的人工土壤置於1 000 mL玻璃燒杯中，將 體長、體重大致相當、已經過馴化的10條蚯蚓放入燒杯 中人工土壤表麵，任其自行鑽入到土壤中。然後用塑料 薄膜封口，紮孔，以防止燒杯內的水分流失和蚯蚓逃逸。 然後將燒杯置於HPG-280H型人工氣候箱內，在溫度 (20±2)°C，相對濕度80%〜85%，光照/無光照時間比為 12 h/12 h光照強度5〜10 ^mol'm+s-1條件下進行培養。 試驗期間，分別在第1、4、7、10和14 d將每個處理組 中所有試樣中的蚯蚓從人工土壤中挑選出來，計數，清 洗幹淨後稱體質量，同時根據情況適時進行水分補充。 1.3.2 亞急性毒性試驗

在急性毒性試驗的基礎上，進行亞急性暴露試驗。 PAM設定5個濃度梯度，分別為0、10、50、250和 500 mg/kg，AM設定6個濃度梯度，分別為0、1、5、25、 50、100 mg/kg。每一個處理設3個重複，同時設空白對 照。人工土壤的處理、蚯蚓的接種以及培養條件與急性 毒性試驗完全相同，隻是將暴露時間調整為70 d，而且 從第3〜6周，每周在土壤表麵添加一次磨細的幹牛糞， 添加標準為每條蚯蚓0.5 g[23]。每7 d將每個處理組中所 有試樣中的蚯蚓從人工土壤中挑選出來，並對蚯蚓數及 其體重進行記錄。6周後將蚯蚓成蟲取出，將含蚓繭和蚯 蚓幼蟲的人工土壤在相同的條件下再培養28 d，第70天 後用熱熏法將幼蟲分離出來並計數。

1.3.3死亡率、生長抑製率和繁殖能力的計算

蚯蚓的死亡率和生長抑製率根據每次觀察時獲取的 數據進行分析計算，而繁殖能力僅根據第70 d獲取的蚯 蚓幼蟲數據進行分析計算。

試驗過程中，頭、尾部對用鈍的探針等機械刺激無 反應的蚯蚓視為死亡，由於蚯蚓死亡後在土壤中會很快 溶解，因此在觀察時蚯蚓減少的數量可認為是已經死亡， 根據蚯蚓死亡的數量計算蚯蚓的死亡率，並用概率回歸 法來計算各試劑對蚯蚓的半致死濃度（LC50)。

將在不同觀察時間獲取到的蚯蚓平均體質量與其在 試驗開始時的平均體質量進行比較，然後利用下列公式 計算其生長抑製率。

I =W^LX100%

w0

式中，/„是《濃度處理的蚯蚓生長抑製率，％; W0是試驗 開始時蚯蚓的體質量，g; W,是第/天時蚯蚓的體質量，g。

試驗期間，死亡了的蚯蚓是不能產繭的，如果在數 據分析時不考慮蚯蚓死亡這一因素，往往會導致因為蚯 蚓的死亡產生對蚯蚓繁殖能力數據分析的影響會高於試 劑本身毒性的影響。因此本試驗中參與數據分析的蚯蚓 幼蟲數是用總的蚯蚓幼蟲數除以到第6周仍存活的蚯蚓 數來得到，這樣計算可以避免因蚯蚓的死亡帶來的對蚯 蚓幼蟲數據分析的影響。

1.4數據分析

在急性毒性試驗中獲取的死亡率數據基礎上，采用 概率回歸的方法計算PAM和AM的LC50。對於試驗中 獲取的其他數據，在滿足正態分布(Shapiro-Wilks W-test) 和方差齊性（Levene’s test)的前提下，采用單因素方差 分析（ANOVA)來評價PAM和AM對蚯蚓生長和繁殖 能力的影響，如果數據不滿足正態分布和方差齊性（即 使在進行了必要的數據轉換之後），則采用非參數檢驗 (Kruskal-Wallis H-test)來分析。同時采用最小差異顯著 法（LSD)(單因素方差分析）和多重比較‘Z’和‘P’ 值（非參數檢驗）來分析不同處理之間的差異顯著性， 所有數據分析采用SPSS17.0軟件完成。

2結果與討論

2.1 PAM和AM對蚯蚓存活的影響 2.1.1急性暴露對蚯蚓存活的影響

本試驗采用LC»來評價急性暴露期內PAM和AM 對蚯蚓存活的影響。聚丙烯酰胺對蚯蚓的毒性效應,PAM濃度在0〜2 000 mg/kg時，蚯 蚓的死亡率為0,但是當濃度達到4 000 mg/kg時，第1 d 的死亡率就達到100%，根據蚯蚓的死亡和人工土壤特征 分析，導致蚯蚓死亡的主要原因不是中毒所致，而是由 於PAM濃度太高而致使人工土壤固結，從而使蚯蚓無法 活動和呼吸而致其死亡。由此說明PAM的LC»遠大於 2 000 mg/kg。這與之前對白鼠的毒性試驗研究結果完全 一致[24-25]，即PAM沒有顯著的急性毒性。

對AM而言，不同暴露時間不同濃度處理中蚯蚓的 LC50計算結果如表1所示。LC50範圍值從164.01到 360.22 mg/kg，隻有在對照處理中，整個暴露期內蚯蚓無 死亡，其他處理中蚯蚓都有不同程度的死亡，而且隨著 AM濃度的增大，蚯蚓死亡率也在上升，存在明顯的劑量 效應關係。從LC50的置信區間來看，第1 d和第4 d沒有 重疊，說明不同濃度AM在4 d暴露期內對蚯蚓的致死效 應差異非常顯著，從第4、7、10、14 d的LC50數據來看， 置信區間重疊範圍較大，而且從第7 d開始完全重疊大， 這就表明從第4 d開始，不同濃度AM在暴露期內對蚯蚓 的致死效應差異不大，從第7 d開始，不同濃度AM對蚯 蚓的致死效應沒有差異。相關研究結果表明AM對 

wagwa 24 和 48 h 的 LC50 為 173.21 和 89.59 mg/L[26]，對白鼠14 d的口攝取的LC50是 177 mg/kg[25]，同樣證明AM是有毒的，而LC5。值之所以 不同，是由於試驗方法和供試動物不同所致。

表1急性暴露期內不同暴露時間聚丙烯酰胺和丙烯酰胺對蚯 蚓的半致死濃度

Table 1 LC50 values calculated for Polyacrylamide and Acrylamide from various durations of acute exposure

2.2 PAM和AM對蚯蚓生長的影響 2.2.1急性暴露期對蚯蚓生長的影響

急性暴露期內，暴露於不同濃度梯度PAM和AM下 的蚯蚓生長抑製率如圖1所示。

暴露時間/d

1471014

 

 

 

 

 

AM

暴露—

時間/dLC50a(mg.kg-1)95%|b言區屍值 c

PAM

LC50a(mg-kg-1)

1360.22(286.50 〜 492.04)0.540>2000

4192.52(168.17〜

227.17)0.407>2000

7164.01(143.73〜 188.42)0.293>2000

10164.01(143.73〜 188.42)0.293>2000

14164.01(143.73〜0.293>2000

注：a. LC50是通過概率回歸計算所得b.括弧內為LC50的95%置信區間； c.P值是通過卡方檢驗所得。

%/#=$常半#1

 

 

2.1.2亞急性暴露對蚯蚓存活的影響

亞急性毒性試驗結果如表2所示，當PAM和AM劑 量分別為500和100 mg/kg時，42 d暴露期內，蚯蚓死亡 率仍然為0,其他所有處理的蚯蚓死亡率也均小於13%。聚丙烯酰胺對蚯蚓的毒性效應, 這說明PAM和AM的亞急性LC50應遠大於試驗設置的 劑量，這就表明PAM和AM在亞急性暴露條件下內對蚯 蚓存活無顯著影響（戶>0.05)。

%/#展s^iH

 

暴露時間/d

b. AM對蚯蚓的生長抑製率影響

圖1急性暴露聚丙烯酰胺和丙烯酰胺對蚯蚓的生長抑製率影

響

Fig.1 Growth inhibition rates in earthworms from acute exposure to Polyacrylamide and Acrylamide

表2亞急性暴露期內聚丙烯酰胺和丙烯酰胺不同處理中蚯蚓 死亡率

Table 2 Death rates of earthworms from sub-acute exposure to

Polyacrylamide and Acrylamide

試劑劑量/(mg_kg-1)死亡率(28 d)死亡率(42 d)

06.67±5.7710.00 士10.00

100.00 士 0.000.00士0.00

PAM5010.00±10.0013.33士5.77

2503.33士5.776.67士5.77

5000.00士0.000.00士0.00

06.67 士 5.7710.00 士10.00

16.67士5.7710.00 士10.00

53.33士5.776.67士5.77

AM250.00士0.003.33士5.77

500.00士0.006.67士11.54

1000.00士0.000.00士0.00

參考農藥毒性標準，當化合物的LC50超過 1 000 mg/kg時，可認為對蚯蚓的存活無毒害作用[23]。根 據農藥環境風險評價規程規定，當LC5〇< 1 mg/kg被認為 是高毒農藥，當LC50在1〜10mg/kg被認為是中毒農藥， 當LC5〇〉10 mg/kg時，被認為是低毒農藥[27]。

結合急性與亞急性毒性試驗的結果表明，PAM是無 毒的，這與其他研究結果是一致的，而AM毒性較小， 濃度小於100 mg/kg時對蚯蚓的存活沒有影響。

在暴露期內，PAM所有處理組中蚯蚓的生長抑製率 全部為負值，這就意味著在暴露期內蚯蚓的體質量是增 加的。在第1、4天，對照中蚯蚓的生長抑製率值高於其 他所有處理組，從第7天開始，對照中蚯蚓的生長抑製 率值比濃度為500、1 000和2 000 mg/kg處理中的低，而 比50、250 mg/kg處理組中的高。低濃度的PAM不僅對 蚯蚓的生長沒有產生抑製作用，反而對其生長有促進作 用，可能是因為PAM具有較好的保水性，改變了人工土 壤的物理特性，從而改善蚯蚓的生存環境。單因素方差 分析的結果表明，PAM對蚯蚓生長沒有顯著影響，數據 分析結果見表3,多重比較的結果表明（Fischer’s LSD)， 不同濃度水平之間的差異也不顯著。這就說明PAM對蚯 蚓的生長發育沒有影響。Hasegawa等人在對白鼠的毒性 試驗中也發現同樣的結果[25]。

在暴露期內，暴露於對照和濃度為25 mg/kg AM處 理中的蚯蚓的體質量有一定增加，而在濃度為100和 200 mg/kg AM處理中的蚯蚓的體質量是減少的。單因素 方差分析結果表明，AM對蚯蚓的生長有顯著影響，數據 分析結果見表3。多重比較的結果表明（Fischer’s LSD)， 不同濃度水平之間，生長抑製率在第一天有顯著差異， 暴露於濃度25〜200 mg/kg AM處理組中的要顯著高於對 照組（戶<0.05)。濃度為100和200 mg/kg AM處理組 之間在第4、7、10和14天暴露時間也存在顯著差異，

 

_—n-

PAM/(mg-kg-)

值

標

均

在這些暴露時間內，暴露於100和200 mg/kg AM處理中

的蚯蚓生長抑製率顯著高於暴露於25 mg/kg處理組和對 照組，聚丙烯酰胺對蚯蚓的毒性效應,而在25 mg/kg AM處理組中與對照組中蚯蚓的生長 抑製率沒有顯著差異。基於以上的數據分析結果，不難推 斷出AM的濃度和蚯蚓的生長抑製率有明顯的劑量效應關 係。與對照相比，當AM濃度大於100 mg/kg時對蚯蚓的 生長發育有顯著的抑製作用。而相關的研究結果表明，當 AM< 150 mg/L不會影響草履蟲（paramecium)的生長[28]。

表3急性暴露期內聚丙烯酰胺和丙烯酰胺對蚯蚓體質量的影

響的單因素方差分析結果

Table 3 Analysis result of variance (ANOVA) for effect of Polyacrylamide and Acrylamide on earthworm

暴露時 間/d變量SSaDFbMScFdP

1PAM0.00750.0010.2700.921

AM0.05130.01719.0530.001

4PAM0.04350.0090.7710.589

AM0.15330.05112.2700.002

7PAM0.04350.0091.1400.392

AM0.15130.05012.9510.002

10PAM0.01950.0040.8110.564

AM0.10330.03414.1710.001

14PAM0.00950.0020.2700.921

AM0.16230.05421.3800.000

注：a. SS，差方和；b. DF，自由度；c.MS,均方差;d. F，F 值；e. P，概率。

2.2.2亞急性暴露期對蚯蚓生長的影響

圖2展示的是在42 d亞急性暴露期內，PAM和AM 對蚯蚓的生長發育的抑製作用。

在PAM暴露試驗中，在第7、14天，對照組中的蚯 蚓生長抑製率比濃度10和50 mg/kg處理組中的高，而比 濃度250和500 mg/kg處理組中的低，這一點與急性毒性 試驗結果完全一致。從第21天，PAM處理組中的蚯蚓生 長抑製率比對照組的要高，即PAM對蚯蚓生長產生一定 的影響，但差異不顯著，不同濃度水平之間對蚯蚓的生 長抑製率也沒有顯著差異（P>0.05)。這就說明，亞急 性暴露期內，PAM對蚯蚓生長發育無明顯的抑製作用。

就AM的5個濃度處理組中蚯蚓的生長抑製率數據 來看，在整個暴露期內，所有處理組中蚯蚓的體質量都 是減少的，這可能是由於人工土壤中營養不足所導致的。 但相對於對照而言，從第7到35天，暴露於AM的處理 組中的蚯蚓生長抑製率要高。雖然方差分析結果表明， AM對蚯蚓的生長抑製率無顯著的影響，但是多重比較的 結果顯示，從第14到35天，對照組和濃度為100 mg/kg 處理組之間的生長抑製率存在顯著的差異（/<0.05)。 而暴露於其他濃度處理中的蚯蚓的生長抑製率與對照之 間沒有顯著差異。這說明，在亞急性暴露期內，當AM 濃度大於100 mg/kg時，對蚯蚓的生長發育影響顯著。 Hasegawa等人的研究發現，聚丙烯酰胺對蚯蚓的毒性效應,當AM的濃度達到 340 mg/kg，從第19天開始，對雄性白鼠的生長發育產生

一定的抑製作用，當濃度超過700 mg/kg,從試驗的一開 始就顯現出嚴重的生長抑製作用[25]。

 

 

 

b. AM對蚯蚓的生長抑製率影響

圖2亞急性暴露聚丙烯酰胺和丙烯酰胺對蚯蚓的生長抑製率

影響

Fig.2 Growth inhibition rates of earthworms from sub-acute exposure to Polyacrylamide and Acrylamide

2.2.3 PAM和AM對蚯蚓繁殖能力的影響

聚丙烯酰胺對蚯蚓的毒性效應,通過蚯蚓幼蟲總數除以到第6周存活下來的蚯蚓數 的平均值來分析PAM和AM在整個亞急性暴露期內對蚯 蚓的繁殖能力的影響。結果見表4。

表4亞急性暴露期內每條蚯蚓所產的蚯蚓幼蟲數 Table 4 Number of juvenile per worm produced after 42 days exposure to Polyacrylamide and Acrylamide

AM/(mg-kg-1)

010502505000152550100

3.67 3.30 3.17 0.70 0.30 3.67 1.731.371.330.63 0.33

準 0.208 0.200 0.208 0.200 0.100 0.208 0.252 0.208 0.208 0.153 0.577

差

注：均值代表存活蚯蚓所產蚯蚓幼蟲的平均值。

與死亡率和生長抑製率相比較而言，蚯蚓的繁殖能 力受PAM和AM的影響更敏感一些。在所有PAM和AM 處理組中，蚯蚓幼蟲的產生量都比對照要低。隨著PAM 和AM濃度的增加，幼蟲數量明顯減少。對照組中蚯蚓 生產幼蟲的能力要明顯高於PAM和AM處理組（戶< 0.05)，不同濃度PAM和AM處理之間，蚯蚓生產幼蟲 的能力也顯著不同，存在著明顯的劑量效應關係。總之， 濃度很低的PAM和AM也會對蚯蚓的生產繁殖能力有顯 著的影響。這一結論也得到了之前相關研究的印證，丁 中海等人研究發現，AM對wagwa的繁殖能力有

一定的影響，產生影響的最小濃度為3.13 mg/L[26]。 Takigamia等人研究發現PAM可以直接導致5.的

DNA損傷，可能是由於PAM包含有的其他成分所致， 如低聚物、共聚物、單體或其他的附加產物[29]。

PAM和AM對蚯蚓的繁殖能力影響很大，AM毒性 效應大於PAM。PAM表現的生殖毒性到底是PAM本身 直接所致，還是其降解產生的單體AM或共聚物所致還 有待深入研究。PAM作為水處理劑大量使用並最終進入 到汙泥中必然會在蚯蚓生物轉化過程中，聚丙烯酰胺對蚯蚓的毒性效應,對蚯蚓的存活、 生長、繁殖產生一定的毒性效應及其所排放環境具有潛 在風險，不過單一的人工土壤環境畢竟與複雜的汙泥環 境不同，因此本研究的結果還不能完全說明汙泥中的 PAM對蚯蚓及其所排放環境的影響程度，還有待未來進 一步的研究。

3結論

急性和亞急性毒性測試表明，聚丙烯酰胺對蚯蚓的 存活和生長沒有顯著的毒性效應，對蚯蚓的半致死劑量 大於2 000 mg/kg。但聚丙烯酰胺對蚯蚓的繁殖能力具有 顯著影響。丙烯酰胺對蚯蚓的毒性較大，當濃度等於和 大於100 mg/kg時對存活和生長即表現出顯著的毒性效 應，對蚯蚓的半致死劑量為164.01 mg/kg。殘留於汙泥中 的聚丙烯酰胺對蚯蚓及排放環境安全構成潛在風險。