2.2 CMW菌株對聚丙烯酰胺的降解

2. 2 1 CMW菌株對聚丙烯酰胺黏度的改變 〇 PCR反應在pTC- 200上進行擴増，20LL的近年來，國外研究者發現聚丙烯酰胺的降解

烴、膠質及瀝青質）與水之間流度比下降，減弱水 的黏性指數，從而提高原油采收率[1].聚合物驅 油的采出液中，不僅含有原油，而且還含有聚丙烯 酰胺，含聚丙烯酰胺的汙水是一類比較複雜、特殊 的汙水，具有含油多，黏度大的特點[2-3].尋找能 產生還原性物質的微生物，促進聚丙烯酰胺的連 鎖氧化降解反應，從而完成聚丙烯酰胺的降解，是 解決含聚汙水外排的重要途徑，聚丙烯酰胺降解菌株分離及其係統發育分析,目前有關聚丙烯 酰胺降解的微生物報道很少.

試驗從大慶油田聚合物配注站的母液罐中篩 選出了降解聚丙烯酰胺的硫酸鹽還原功能菌株， 進行生理生化、16S DNA序列和16S~ 23S iDNA 間隔區序列克隆測序，對其係統發育進行分析，同 時對聚丙烯酰胺降解進行初步研究.

1材料和方法

1.1菌種的來源、實驗材料

菌種來源於大慶油田五廠十三區聚合物配注 站，取樣點為注入工藝母液罐中的聚合物水溶液 (8000mg/L 洱=7.8~8.0).

采用Hungate厭氧操作技術、絕跡稀釋法[4] (MPN)以及/滾管”培養對樣本進行分離，多次純 化獲得純菌株CMW.具體方法：向改良後Starkey 培養基（K2HPO4 0■ 5 g，NH4C 11.0 g Na2S〇4 2 g CaCl. 2H2O 0■ 1 g MgSO4 • 7H2O 2. 0 g 酵母膏 1.0 g 60%的乳酸鈉溶液6 mL蒸餾水1000 mL 7 8)中加入0.2%的刃天青溶液，培養基煮 沸後，加入L-半光鹽酸鹽0. 5 g通入高純氮氣 驅氧 30mi，121 °C 滅菌 20min 3% 的 FeS〇4 • (NH4)2 SO4溶液單獨加入，固體培養基加入 1. 6%的瓊脂糖.CMW菌株於液體培養基中38 °C 培養48 h後，在光學顯微鏡（O ympus COVER - 018)下革蘭氏染色觀察，透射電鏡（H2600A，H- TACHI)下觀察菌體的形態和結構.按簡明第八 版伯傑氏細菌鑒定手冊》進行生理鑒定.

1. 2 16S IDNA和 16S~ 23S IDNA 間隔區序列 的克隆與測序

用試劑盒(寶生物公司）提取菌株DNA，采用 通用引物進行PCR擴増，16S iDNA序列的引 物[5] Eubac27F: 5' - AGAGTTTGATCCTGGCT- CAG- 3.，1492R： 5. - GGTTACCTTGTTACGACTT -3’； 16S~ 23S DNA 間隔區的引物[6] P1 5’ - GGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA- 3’， P2 5’ - CCTCTGACTGCCAGGGCATCC- 3’；引物由大連 寶生物有限公司合成.

反應體係內含:模板40 ng左右，TagDNA聚合酶 (大連寶生物）終濃度為0■ 3 U，dNTP為 0. 3mmo1/L引物各0. 1 Lmol/I;擴増程序為： 94 °C預熱 5 m n 94 °C變性 30 s 58 °C複性 45 s 72 °C延伸90 s循環30次，最後72 °C延伸 10m in擴増產物與1. 0%的瓊脂糖電泳檢測.用 膠回收試劑盒(寶泰克）切膠回收，後與pGEM - T (Piomega)載體連接，轉化到大腸杆菌TOP10感 受態細胞（天為時代）.LB固體培養基中加入氨 苄青黴素Amp(5Lg/mL)和X- gal藍白斑篩選 轉化子.提取質粒（華舜），用載體引物T7和SP6 檢測.測序由上海生物工程有限公司完成.

將測得的 16S iDNA、16S~ 23S iDNA 間隔 區序列在GenBank進行Blast對獲得的同源序 列進行序列分析.用BbEditv5.06進行多序 列比對，采用MEGA3.1軟件中的鄰接法構建 進化樹.

1.3分析方法

硫化氫氣樣采用Sp- 2000型氣相色譜儀進 行分析，FPD檢測器，聚丙烯酰胺降解菌株分離及其係統發育分析,柱溫60 °C，以25% B，B -氧 二丙晴為固定相；液相末端產物分析：中國產 GC112型氣相色譜儀，氫火焰離子檢測氣，測定條 件（擔體 GDX- 103(60- 80 目）+ 2%H3P〇4,填 充柱長2 m x <5 mm，載氣N;進樣量2 LL);聚 合物濃度:澱粉-碘化鎘法;聚合物黏度測定，采 用H akke Bush黏度儀，恒溫水浴45 °C，轉子轉速 6 r/min;聚丙烯酰胺幹粉、水作用後的聚丙烯酰 胺以及微生物降解產物幹粉，經KBr壓片，采用 紅外光譜法（Spectrum One FFR，PE)進行分析.

2結果與分析

2.1形態和生理生化鑒定

CMW菌株為杆菌，長度在0.4~ 0. 6 Lm x 0. 6Lm~ 3. 0Lm，G+，無芽孢，能運動，有4根鞭

毛（圖1).在含有亞鐵鹽的乳酸鹽-硫酸鹽固體 培養基中形成黑色圓形菌落，表麵凸起、光滑，邊 緣整齊.利用硫酸鹽、亞硫酸鹽和還原性硫化物起 電子受體作用，並還原成H2S保留時間為0. 323 (圖2)，嚴格厭氧.碳源為乳酸鈉、蘋果酸、葡萄 糖、琥珀酸、酵母膏和蛋白腖的培養基中生長.不 同碳源作為底物中生長狀況各異，在酵母膏中生 長最好.能以硫酸氨、尿素為氮源.液相末端產物 為乙酸、丙酸、丁酸、乙醇.

net 

產物可作為細菌生命活動的營養物質，細菌對降 解產物的消耗促進聚丙烯酰胺的降解.選用抗鹽 聚丙烯酰胺（KYPMA1600)，代替乳酸鈉作為碳 源，用蒸餾水配製成不同質量濃度聚丙烯酰胺 (50 mg/L、 100 mg/L、 150 mg/L、 200 mg/L、 400mg/L、 600 mg/L、 800 mg/L、 1000 mg/L、 1200mg/L)培養基，滅菌後加入3%»維生素C；作 為還原劑消耗經過高壓滅菌產生的自由基|71，接 種量為10%.接種後54 h記數的結果表明，聚丙 烯酰胺質量濃度在400~ 800mg/L時細菌數量較 大，最適宜的質量濃度為600 mg/L由圖3可見， 質量濃度為600mg/L時CMW菌株生長曲線和 聚丙濃度變化，在培養後的36 h進入對數生長 期，72 h後進入穩定期.特別是進入對數生長期 聚丙濃度降低較快.同時選擇4個點測定了聚丙 烯酰胺溶液黏度，黏度變化較大，由接種時的 18. 5mPa•到第 48 h的 8. 6mPa. s 至第 168 h 的3.4mPa. s第480h的1.1mPa. s該菌株對 於降低黏度效果顯著.

生長曲線

CMW菌株的透射電鏡照片(

50000)

0.260.280.30 0.320.34 0.360.38

t/min

圖2 H2S氣體在氣相色譜中的保留時間

•聚合物濃度

培養時間/d

圖3 600mg/L時CMW菌株的生長曲線和聚丙濃度變化

2.2 2 CMW菌株對聚丙烯酰胺結構的改變

聚丙烯酰胺降解產物中，低相對分子質量化 合物除含雙鍵、環氧和羰基的聚丙烯酰胺碎片外， 聚丙烯酰胺降解菌株分離及其係統發育分析,大多屬於一般丙烯酰胺低聚體的衍生物.由圖4 可見,水作用後的吸收峰與幹粉樣品相比出現新 的峰值，1567. 32峰代表羰基，3433. 22峰代表N -C鍵斷裂;菌株作用後,相對於樣品和水溶液， 在620. 36到1298. 76峰值是各種不同的苯環結 構，多為菌株降解的產物.表明CMW菌株以聚丙 烯酰胺為碳源和氮源，降解側鏈，部分官能團發生 改變，導致聚丙烯酰胺斷鏈和溶液黏度下降.

2. 3 16S lDNA 序列和 16S~ 23S lDNA 間隔區 序列係統發育學分析

經測序後獲得1536bp的16S iDNA序列， GenBank登錄號為DQ011249,序歹J在GenBank中

進行比對，挑選同源序列分值較高的有代表性菌 株，以Therm o togasp. ( A J872271 )、

Desuforh〇pa1us vacuo latus ( DSRRG )為參比菌 株，采用NJ法構建係統進化樹.

由圖5可見，係統發育樹中參比菌株與其他 參試菌株明顯地分開，14個菌株的平均遺傳距離 為0. 1790(方差為0.0079). 16S iDNA序列比對 的結果表明，CMW 菌株與 Clos/ridium. stick land ii (CLORRSA)的相似性水平達98%，該菌株分離 自生產氨的廢水中，而CMW菌株分離自純聚合 物的母液罐中，能以聚丙烯酰胺為唯一碳源，不發 生毒害作用，並且具有硫酸鹽還原功能，結合菌株 的形態和生理生化特性，初步鑒定可能為梭菌屬 的新種，暫時命名為Clos/ridium. stick land ii CMW.獲得16S~23S DNA間隔區序列長度為 346bp 隻有 Thermo toga .sp.( AJ872271 )，

Methylobacterium ex/orquens (AF293375)同時具 有16S DNA和間隔區序列，相似性分別為70%， 79%，與 P. iwicus (PI16SRRNA)相似性為 98%.研究表明，16SiRNA基因序列更為保守些， 

rRNA之間的基因間隔區因為沒有特定功能，進 化速率比16S iRNA大10多倍[8]，更加適合屬內 種水平上的鑒定.革蘭氏陽性細菌多編碼RNAAk 或RNA'革蘭氏陰性細菌根據間隔區的片段長 短不等編碼 RNA(;i1， RNALys 和 tRNAVa， RNAAk、tRNAu和tRNA(;k，還有部分間隔區根本

不含tRNA基因[9-11].本菌株排列方式16S iRNA -RNAIfc- RNAAk- 23S RNA，含有兩個 tRNA 基因，即 tRNA11'和 tRNAAk.與 Themotoga (AJ872271 )，M ethylobacteriumex torquens

(AF293375)具有相同的基因結構. 

 圖5基於CMW菌株和相近的菌株16S rDNA序列構建的NJ係統發育樹 

3結論

1)應用Hungate厭氧技術分離到的CMW菌 株，為杆菌，長度在0■ 4~ 0-6 Lm @ 0. 6 Lm ~

3.0 Lm，G+，無芽孢，能運動，有4根鞭毛，具有硫 酸鹽還原功能，產H2^嚴格厭氧.

2)(MW菌株能以聚丙烯酰胺為唯一碳源，降解

側鏈，其部分官能團發生改變，聚丙烯酰胺溶液黏度 下降效果顯著，聚丙烯酰胺降解菌株分離及其係統發育分析,具有較高的聚丙烯酰胺降解能力.

3 ) CMW 菌株與 Cbstridium. stickkindii (CLORRSA)的相似性水平達98%，結合菌株的 形態和生理生化特性，初步鑒定可能為梭菌屬的 新種，暫時命名為 Clostridium sticklandii CMW.